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Solução de problemas para sinal elevado de ELISA
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| 1. |
A solução de substrato TMB estava contaminada |
Use uma solução fresca de substrato TMB, que deve ser clara e incolor antes da adição aos poços. Use um recipiente limpo de fundo V antes de pipetar a solução de substrato para os poços. |
| 2. |
Reação não parada |
A cor continuará a desenvolver-se se a reação do substrato não for interrompida. |
| 3. |
Placa deixada muito tempo antes de leitura no leitor de placas |
A cor continuará a desenvolver-se (embora numa taxa mais lenta se a solução de paragem tiver sido adicionada). |
| 4. |
Contaminantes de objetos de vidro de laboratório |
Certifique-se de que os reagentes são recentes e preparados em objetos de vidro limpos. |
| 5. |
Incubação de substrato realizada à luz |
A incubação do substrato deve ser realizada no escuro. Assegure-se de que o substrato não está exposto à luz - armazene-o num local escuro. Limite a exposição à luz durante a execução do ensaio. |
| 6. |
Poços estão insuficientemente lavados |
Lave os poços conforme as recomendações do protocolo. |
| 7. |
Demasiado reagente de deteção adicionado |
Certifique-se de que o reagente foi diluído adequadamente ou diminua a concentração recomendada do reagente de deteção. |
| 8. |
Tampão de bloqueio ineficaz (por exemplo, o reagente de deteção liga-se ao bloqueador; os poços não estão completamente bloqueados) |
Experimente reagente de bloqueio diferente e/ou adicione reagente de bloqueio para lavar o tampão. |
| 9. |
Concentração de sal nos tampões de incubação/lavagem |
Concentrações salinas crescentes podem reduzir interações não-específicas e/ou fracas com o alvo. |
| 10. |
Elevada concentração de anticorpos |
Tente diferentes diluições para obter melhores resultados. |
| 11. |
Precipitado formado nos poços após adição de substrato |
Aumente o fator de diluição da amostra ou diminuir a concentração do substrato. |
| 12. |
Placa suja |
Limpe o fundo da placa. |
| 13. |
Diluições de curva padrão incorretamente preparadas |
Verifique a sua técnica de pipetagem. A calibração de pipetas pode ser necessária. |
| 14. |
Tempos de incubação mais longos do que os recomendados |
Certifique-se de que os seus tempos de incubação estão corretos e cumpra o protocolo fornecido com o manual técnico |
| 15. |
Seladores de placas ou reservatórios de reagentes reutilizados, resultando na presença de HRP residual. Isso irá tornar o TMB azul de forma não específica.
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A reutilização de selantes da placa pode levar à presença de HRP residual, levando a uma mudança de cor não específica do TMB. Para evitar isso, use um selador de placa novo e um reservatório de reagente para cada etapa |
| 16. |
Contaminação de tampões |
Tenha sempre tampões novos.
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Solução de problemas do ELISA para
Fora do Limite
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| 17. |
As amostras não contêm ou contêm níveis inferiores detetáveis de analito |
Se as amostras estiverem abaixo dos níveis detetáveis, pode ser possível usar uma amostra de volume alto. Consulte o suporte técnico para modificações apropriadas de protocolo. |
| 18. |
As amostras contêm concentrações de analito superiores ao ponto padrão mais alto |
As amostras podem exigir diluição adicional. |
| 19. |
Lavagem insuficiente |
Use o procedimento de lavagem apropriado - veja abaixo. No final de cada etapa de lavagem, inverta a placa no tecido absorvente e deixe escorrer completamente, batendo com força, se necessário, para remover qualquer fluido residual. |
| 20. |
Seladores de placa não usados ou reutilizados |
Durante as incubações, cubra as placas de ensaio com selantes de placa. Use um selante novo cada vez que a placa for aberta. Isso evitará que os poços se contaminem mutuamente. |
| 21. |
Diluições incorretamente preparadas |
Verifique a técnica de pipetagem - veja abaixo - e confirme os cálculos. |
| 22. |
Tempos de incubação mais longos do que os recomendados |
Kits fabricados têm protocolos otimizados. Certifique-se de seguir os tempos de incubação recomendados. Se estiver a desenvolver o ELISA usando pares de anticorpos, talvez seja necessário otimizar o ensaio. Para mais informações, veja Desenvolvimento e Otimização Elisa. |
| 23. |
Solução de substrato misturada cedo demais, tendo ficado azul |
A solução de substrato deve ser misturada e usada imediatamente. |
| 24. |
Demasiada estreptavidina-HRP |
Verificar a diluição, dosear, se necessário. |
| 25. |
Seladores de placas ou reservatórios de reagentes reutilizados, resultando na presença de HRP residual. Isso irá tornar o TMB azul de forma não específica. |
Para evitar isso, use um selador de placa novo e um reservatório de reagente para cada etapa. |
| 26. |
Tampões contaminados com metais ou HRP |
Tenha sempre tampões novos. |
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Solução de problemas do ELISA para
Variação Elevada
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| 27. |
Erros de pipeta multicanal |
Calibre as pipetas. |
| 28. |
A lavagem da placa não foi adequada ou uniforme |
Certifique-se de que as pontas das pipetas estão bem fixadas. Confirme se todos os reagentes foram completamente removidos em todos os passos da lavagem. |
| 29. |
Amostras não homogéneas |
Misture cuidadosamente as amostras antes de pipetar. |
| 30. |
As amostras podem ter alto teor de partículas |
Remova o teor de partículas por centrifugação. |
| 31. |
Agitação insuficiente da placa |
A placa deve ser agitada durante todas as etapas de incubação, usando um agitador de placas ELISA, a uma velocidade onde as soluções nos poços estejam em constante movimento sem salpicar. |
| 32. |
Contaminação entre poços |
Ao reutilizar os selantes de placa, verifique se nenhum reagente tocou o selante. Deve ter-se cuidado ao usar as mesmas pontas de pipeta utilizadas para adições de reagentes. Certifique-se de que as pontas das pipetas não tocam os reagentes na placa. |
| 33. |
Placas empilhadas durante as incubações |
O empilhamento de placas não permite uma distribuição uniforme da temperatura nos poços das placas. Evite empilhar. |
| 34. |
Pipeta inconsistente |
Assegure-se de que as pipetas estão a funcionar corretamente e estão calibradas. Certifique-se de que as pontas das pipetas são empurradas para longe o suficiente para criar uma boa vedação. Tome especial cuidado ao diluir a placa e observe se as pontas das pipetas estão a pegar e a libertar a quantidade correta de líquido. |
| 35. |
Diluições/reagentes de anticorpos não estão bem misturados |
Para garantir uma concentração consistente em todos os poços, certifique-se de que todos os reagentes e amostras são misturados antes de pipetar nas placas. |
| 36. |
Poço permitido secar |
Certifique-se de que as tampas são deixadas nas placas o tempo todo durante a incubação. Coloque uma bandeja de água humidificadora (água engarrafada limpa / esterilizada) na parte inferior da incubadora. |
| 37. |
A parte inferior da placa está suja |
Limpe o fundo da placa com cuidado antes de reler as placas. |
| 38. |
Bolhas nos poços |
Certifique-se de que não há bolhas antes de ler a placa. |
| 39. |
Efeitos laterais |
Certifique-se de que a placa e todos os reagentes estão à temperatura ambiente. |
| 40. |
Armazenamento |
Assegure-se de que os reagentes e as amostras estão armazenados à temperatura correta. |
| 41. |
O anticorpo de captura não se ligou à placa |
Certifique-se de que está a usar uma placa ELISA, não uma placa de cultura de tecidos. Dilua o anticorpo em PBS. Garanta a preparação e o tempo de incubação corretos para as etapas de revestimento e bloqueio. |
| 42. |
Variações em protocolos |
Adira ao protocolo que acompanha o seu ensaio. |
| 43. |
Cálculos impróprios da curva padrão |
Verifique os cálculos, faça uma nova curva padrão e use controles internos. |
| 44. |
Tampões contaminados |
Use tampões novos. |
| 45. |
Fundo do poço desfeito |
Evite o contacto com o fundo do poço durante a pipetagem. Aponte a ponta da pipeta para o lado do poço para evitar perturbar o fundo. |
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Solução de problemas do ELISA para
O fundo é alto
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| 46. |
Os fundos dos poços foram contaminados |
Evite a contaminação entre poços usando adequadamente o selante. Use pipetas multicanais sem tocar nos reagentes na placa. |
| 47. |
A matriz usada tem analito ou interferência endógena |
Verifique os ingredientes da matriz quanto a componentes de reação cruzada (por exemplo, meio de cultura de tecidos modificado com interleucina). |
| 48. |
Lavagens insuficientes |
Aumente o número de lavagens. Aumente o tempo de imersão entre lavagens antes da adição da solução de substrato. |
| 49. |
Reatividade cruzada |
Anticorpo de deteção com reatividade cruzada com o anticorpo de revestimento. Execute os controles apropriados. |
| 50. |
Ligação não específica de anticorpos |
Certifique-se de que uma etapa de bloco está incluída e que um tampão de bloqueio adequado está a ser usado. Recomendamos o uso de 5 a 10% de soro da mesma espécie do anticorpo secundário ou soro bovino. Certifique-se de que os poços são pré-processados para evitar a ligação não específica. Use um anticorpo purificado por afinidade, de preferência pré-absorvido. |
| 51. |
Concentração de segundo anticorpo conjugado muito elevada |
Realize diluições para determinar a concentração ideal do trabalho. |
| 52. |
Temperatura incorreta do ensaio |
Verifique se a temperatura de incubação não excedeu 37°C |
| 53. |
Lavagem inadequada |
Certifique-se de que todos os poços estão a encher com tampão de lavagem e estão a ser aspirados completamente. Use uma máquina de lavagem automática de placas, se disponível. Aumente o número de lavagens. Adicione 30 segundos na etapa de imersão entre as lavagens. |
| 54. |
Enzimas contaminantes presentes na amostra |
Teste a amostra apenas com substrato para verificar a atividade da enzima contaminante. |
| 55. |
Poços estão insuficientemente lavados |
Lave os poços conforme as recomendações do protocolo. |
| 56. |
Tampão de lavagem contaminado |
Prepare tampões novos. |
| 57. |
Demasiado reagente de deteção adicionado |
Certifique-se de que o reagente foi diluído adequadamente ou diminua a concentração recomendada do reagente de deteção |
| 58. |
Tampão de bloqueio ineficaz |
Experimente reagente de bloqueio diferente e/ou adicione reagente de bloqueio para lavar o tampão |
| 59. |
Concentrações de sal nos tampões de incubação/lavagem |
Concentrações salinas crescentes podem reduzir interações não-específicas e/ou fracas com o alvo. |
| 60. |
Esperar demasiado tempo para ler a placa após a adição da solução de paragem |
Leia a placa imediatamente após adicionar solução de paragem. |
| 61. |
Elevada concentração de anticorpos |
Tente diferentes diluições para obter melhores resultados. |
| 62. |
Incubação de substrato realizada à luz |
Incubações de substrato devem ser realizadas no escuro ou como recomendado pelo fabricante. |
| 63. |
Precipitado formado nos poços após adição de substrato |
Aumente o fator de diluição da amostra ou diminua a concentração do substrato. |
| 64. |
Placa suja |
Limpe o fundo da placa com um pano. |
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Solução de problemas do ELISA para
Sem Sinal
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| 65. |
Anticorpo incorreto ou sem deteção foi adicionado |
Adicione o anticorpo de deteção apropriado e continue. |
| 66. |
Avidina-HRP não foi adicionada |
Adicione avidina-HRP de acordo com o protocolo e continue. |
| 67. |
Solução de substrato não foi adicionada |
Adicione a solução de substrato e continue. |
| 68. |
Tampão de lavagem contém azida |
Evite azida sódica no tampão de lavagem. |
| 69. |
Tempo de incubação demasiado curto |
Incubar as amostras durante a noite a 4°C ou seguir as orientações do fabricante. |
| 70. |
Alvo presente abaixo dos limites de deteção do ensaio |
Diminua o fator de diluição ou concentre as amostras. |
| 71. |
Tipo de amostra incompatível |
A detecção pode ser reduzida ou ausente em tipos de amostras não testadas. Inclua uma amostra cujo ensaio é conhecido por detectar o controle positivo. |
| 72. |
Reconhecimento do epítopo impedido pela placa de absorção |
Para aumentar a deteção de um peptídeo por ELISA direto ou indireto, conjugue o peptídeo com uma grande proteína transportadora antes de aplicar o revestimento numa placa de microtitulação. |
| 73. |
Incompatibilidade do tampão de ensaio |
Certifique-se de que o tampão de ensaio é compatível com o alvo de interesse (por exemplo, atividade enzimática retida, interações de proteína retidas). |
| 74. |
Reagente de deteção insuficiente |
Aumente a concentração da quantidade de reagente de deteção seguindo as orientações do fabricante. |
| 75. |
Amostra preparada incorretamente |
Assegure a adequada preparação/diluição da amostra. As amostras podem ser incompatíveis com o formato de ensaio da placa de microtitulação. |
| 76. |
Anticorpo insuficiente |
Tente diferentes concentrações/diluições de anticorpos. |
| 77. |
A temperatura de incubação é demasiado baixa. |
Assegure-se de que as incubações são realizadas à temperatura correta. Todos os reagentes, incluindo a placa, devem estar à temperatura ambiente ou conforme recomendado pelo fabricante antes de prosseguir. |
| 78. |
Comprimento de onda incorreto |
Verifique o comprimento de onda e leia a placa novamente. |
| 79. |
A lavagem da placa é muito enérgica |
Verifique a pressão correta na lavagem automática de placas. Limpe cuidadosamente o tampão de lavagem com pipeta se as lavagens forem feitas manualmente. |
| 80. |
Poços secos |
Não permita que os poços fiquem secos após o início do ensaio. Cubra a placa usando película ou fita de vedação para todas as incubações. |
| 81. |
Desenvolvimento de cor lenta das reações enzimáticas |
Prepare a solução de substrato imediatamente antes de usar. Assegure-se de que a solução de reserva não expirou e não está contaminada. Permita uma incubação mais longa. |
| 82. |
Cor desigual
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Certifique-se de que todos os poços são lavados corretamente. Use uma máquina de lavar placas ELISA sempre que possível. |
| 83.
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Reagentes não estão à temperatura ambiente
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Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente, desde o início do ensaio. A temperatura ambiente deve ser alcançada após 15 a 20 minutos de repouso. |
| 84. |
Reagentes expirados |
Assegure-se de que todos os reagentes utilizados estão dentro da data. |
| 85.
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Formato de ensaio insuficientemente sensível |
Mude para um tipo de ensaio mais sensível (por exemplo, ELISA direto para ELISA sanduíche). Prolongue os tempos de incubação ou aumente a temperatura. Ou mude o método de deteção. |
| 86. |
Tampão contendo FCS utilizado para reconstituir anticorpos |
Reavalie os reagentes utilizados. |
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Solução de problemas do ELISA
Baixa Curva Padrão
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| 87. |
O padrão foi reconstituído incompletamente ou foi armazenado incorretamente |
Reconstitua o padrão de acordo com o protocolo fornecido e siga as instruções de armazenamento. |
| 88. |
Reagentes foram adicionados aos poços em concentrações incorretas |
Verifique se há erros de pipetagem e corrija o volume do reagente. |
| 89. |
Incubações feitas a temperatura incorreta |
Siga o protocolo para armazenamento, incubação e agitação. |
| 90. |
Poços não completamente aspirados |
Aspire completamente entre as etapas; use a lavagem da placa sempre que possível. |
| 91. |
Placas empilhadas durante a incubação |
Mantenha as placas separadas. |
| 92. |
Série de diluição fraca |
Verifique os passos de diluição de acordo com o protocolo. |
| 93. |
Reagentes mal misturados |
Certifique-se de misturar os reagentes cuidadosamente. |
| 94. |
Adsorção pobre ou variável de reagentes para placa |
Verifique a escolha do tampão de revestimento, geralmente PBS com um pH de 7,4 ou tampão de carbonato-bicarbonato pH 9,6. Tente alargar este tempo de incubação ou considere o uso de placas diferentes. |
| 95. |
Padrão degradado |
Verifique se o padrão foi armazenado corretamente. |
| 96. |
Curva não se adequa à escala |
Tente traçar o uso de diferentes escalas, por exemplo, log-log, ajuste de curva logística de 5 parâmetros. |
| 97. |
Erro de pipetagem |
Verifique as pipetas e calibre. |
| 98. |
O anticorpo de captura não se ligou à placa |
Certifique-se de que está a usar uma placa ELISA, não uma placa de cultura de tecidos. |
| 99. |
Insuficiente deteção de anticorpo |
Verificar a diluição, dosear, se necessário. |
| 100.
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Cálculo incorreto da diluição da curva padrão |
Verifique os seus cálculos e faça uma nova curva. |
| 101. |
Misturando ou substituindo reagentes de kits diferentes |
Evite isso, pois tal pode afetar a qualidade do seu ensaio. |
