ELISAは、抗体を利用してサンプル中に存在する因子を定量する手法です。 免疫学、神経科学、癌の研究で一般的に使用され、炎症、成長因子、シグナル分子などさまざまなターゲットを分析します。 主なターゲットには、IL6、IL8、BDNF、VEGF が含まれます。

ELISAの種類

ELISAには2つのタイプがあります。それはサンドイッチELISAと競合ELISAです。 サンドイッチ（抗体がプレートに結合）および競合（抗原がプレートに結合）ELISAは2つの主要な抗体結合ステップを含みます。その過程で、不要な因子、未結合抗体、低親和性複合体の除去を行う洗浄ステップが重要となっています。

TMB反応

ELISAではさまざまな基質を使用して、最終的な抗原抗体反応複合体を検出します。 主に比色分析、化学発光分析、蛍光分析の、3つの技術があります。 一般的にELISAは、サンプルの比色分析に基づく測定を指します。基質となるTMB（3,3 ',5,5'-テトラメチルベンジジン）は、酵素である西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）の存在下で過酸化水素を水に還元するための水素供与体として機能します。 この反応により、溶液の色を青に変えるdiimineが生成されます。 この青色の溶液は、370および650 nmの分光光度計で読み取ることができます。 この反応を停止するために硫酸を加えると、黄色に変色します。 この黄色の溶液を分光光度計により450 nmで読み取ります。

ELISAで洗浄が重要な理由

ELISAでの測定において、 バックグラウンドシグナルを減少させるために、洗浄ステップは大変重要です。洗浄が不十分な場合、未反応の標識抗体が原因となりシグナル－ノイズ比が増加します。バックグラウンドが高くなることで、サンプル間のばらつきが大きくなり、結果に悪影響を及ぼします。洗浄作業により未反応の標識抗体を除くことで、抗原と反応した抗体のみの検出感度を上げることができます。

洗浄バッファー量

ELISAプレートに加えられる洗浄バッファーの量も，十分な洗浄をするために重要なポイントです。プレートウォッシャーを使用するかマルチチャンネルピペットを使用するかにもよりますが、洗浄バッファー量に注意してください。 洗浄バッファーの量は、各ウェルに追加されたコーティングバッファーの量よりも多くする必要があります。 たとえば、プレートが100µLのコーティングバッファーでコーティングされている場合、ウェルを完全に洗浄するために、200〜350 µL程度の洗浄バッファーを加える必要があります。

洗浄回数

バックグラウンドの低下だけでなく、抗原と結合した分析物の不必要な洗浄を防ぐために、洗浄回数も重要なポイントです。 サンプルが過剰に洗浄されると、シグナルが低下し、定量が困難になる場合があります。 手順書に従い、1回、3回あるいは5回の洗浄が必要になる場合があります。 一般に、プレコーティングされたプレートは、DIYコーティングされたプレートよりも少ない洗浄回数で済みますが、これはメーカーと技術に依存する場合があります。

洗浄バッファーの吸引–用手法の場合

洗浄バッファーの吸引は、残留バッファー、不要な複合体および抗体を除去するための鍵となります。 マルチチャンネルピペットを使用する場合は、洗浄ステップ間でマルチチャンネルに新しいピペットチップを使用します。 バッファーを吸引する場合、ウェルの側面や底に触れないように注意しながら、マルチチャンネルをウェルに斜めの角度で配置します。 バッファーを除去した後、プレートを裏返し、ペーパータオルでプレートを軽くたたいて残液を除去します。プレートを乾燥させないよう注意してください。