ELISA バッファーとレシピ

ブロッキングバッファーは、プレートの表面へ非特異的に結合するタンパク質溶液、またはタンパク質・化合物の混合液です。

ブロッキングバッファーはバックグラウンドとS / N比を下げるため、ELISAの感度を向上させるのに効果的です。

すべての非特異的部位に対して効果を発揮し、バックグラウンドを低下させ、抗体が結合する測定対象抗原のエピトープに影響することなく非特異的シグナルを低減するブロッキングバッファーが理想的です。

ELISAコーティングバッファーは、タンパク質/分析物または抗体をマイクロタイタープレートに固相化するために使用します。 マイクロタイタープレートへの測定因子/抗体固相化における重要な要因は、コーティングバッファーのpHです。 pH 7.4からpH 9.6の間のコーティングバッファーを選択すると、タンパク質/抗体/測定因子が結合する立体構造に影響を与える恐れがあり、固相化にも影響します。 コーティングバッファーのテストは、固相化抗体の可動性とパフォーマンスの向上に役立ちます。

HRP (Horseradish peroxidase、西洋わさびペルオキシダーゼ）の存在下では、TMB基質は過酸化物と反応し、605 nmで最大の吸光度を持つ青色の副産物を生成します。 HRPの酵素活性によって生成される色の強度は、測定因子の量に比例します。 　　　　TMB基質溶液のインキュベーション後、0.16M硫酸の反応停止液を加えて反応を停止します。 追加する停止液の量は、ELISAプレートの各ウェルに添加するTMB基質の量と同じにする必要があります（通常、1ウェルあたり50〜100 uL）。 反応停止溶液の添加後は色が青色から黄色に変化、発色が安定します。分光光度計を使用して450nmでの吸光度を測定します。

アルカリホスファターゼ標識抗体には、アルカリホスファターゼの発色基質であるpNPPを使用します。 アルカリホスファターゼは、pNPPからpNPへの加水分解を触媒します。 これにより、405nmで最大の吸収を持つ黄色のフェノラートが生成されます。 pNPPは光に敏感であるため、光を避ける必要があります。

ELISAでの洗浄ステップの目的は、発色に影響を及ぼす夾雑物を除去し、ELISA成分を保存することです。 ELISAプレートは、スタンダードおよびサンプルの添加前、検出抗体の添加後、およびHRP標識抗体の添加後に洗浄します。 ELISAでは、TrisベースとPBSベースのウォッシュバッファーを使用できます。