ELISA バッファーとレシピ
ELISA バッファーとレシピ
ELISA に用いる主要なバッファーの役割と、すぐに使えるレシピ集。ブロッキング、コーティング、基質・反応停止液、各種ウォッシュバッファーを日本語でまとめました。
← 日本語リソースへ戻る1ブロッキングバッファー
ブロッキングバッファーは、プレート表面への非特異的な結合を防ぐためのタンパク質溶液（またはタンパク質・化合物の混合液）です。
バックグラウンドと S/N 比を下げることで、ELISA の感度向上に効果的です。
理想的なブロッキングバッファーは、抗体が結合する測定対象抗原のエピトープに影響を与えることなく、すべての非特異的部位を覆い、非特異的シグナルを低減します。
| ブロッキングバッファーのレシピ |
|---|
| リン酸緩衝生理食塩水（PBS） |
| 1% BSA |
2コーティングバッファー
ELISA コーティングバッファーは、タンパク質・分析物または抗体をマイクロタイタープレートに固相化するために使用します。最も重要な要因はコーティングバッファーの pH です。pH 7.4〜9.6 の範囲で選択すると固相化に影響し、タンパク質・抗体の立体構造にも影響を与える可能性があります。コーティング条件を検討することで、固相化抗体の可動性とパフォーマンスの向上に役立ちます。
| 成分（1 L あたり） | 分量 |
|---|---|
| Na₂CO₃ | 1.5 g |
| NaHCO₃ | 2.93 g |
| 蒸留水 | pH 9.6 に調整 |
3基質と反応停止液
TMB（3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン）
HRP（西洋わさびペルオキシダーゼ）の存在下で、TMB 基質は過酸化物と反応し、605 nm に極大吸収を持つ青色の生成物を生じます。発色強度は測定因子の量に比例します。インキュベーション後、0.16 M 硫酸などの反応停止液を加えて反応を停止します（通常 1 ウェルあたり 50〜100 µL、基質と同量）。停止液の添加後は青色から黄色へと変化して発色が安定し、分光光度計を用いて 450 nm で吸光度を測定します。
pNPP（p-ニトロフェニルリン酸）
アルカリホスファターゼ標識抗体には、発色基質として pNPP を使用します。アルカリホスファターゼが pNPP から pNP への加水分解を触媒し、405 nm に極大吸収を持つ黄色のフェノラートを生成します。pNPP は光に敏感なため、遮光して取り扱ってください。
4ウォッシュバッファー
洗浄ステップの目的は、発色に影響する夾雑物を除去し、ELISA 成分を保持することです。スタンダード・サンプルの添加前、検出抗体の添加後、および HRP 標識抗体の添加後に洗浄します。ELISA では Tris ベースと PBS ベースのいずれのウォッシュバッファーも使用できます。
PBS ベースのウォッシュバッファー
| 成分 |
|---|
| PBS |
| 0.05%（V/V）Tween 20 |
Tris ベースのウォッシュバッファー（1 L）
| 成分 | 分量 |
|---|---|
| Tris 塩基 | 6.06 g |
| NaCl | 8.2 g |
| 6 M HCl | 6.0 mL |
| 蒸留水 | 1 L まで |
| pH / 導電率 | pH 7.2〜7.8、14,000〜16,000 |
TBS ベースのウォッシュバッファー
| 成分 | 分量 |
|---|---|
| TBS | 1 L |
| 10% Tween 20 | 5 mL |
5関連する日本語ガイド
ELISA ワークフローに役立つ、その他の日本語ガイドもあわせてご覧ください。