Co-Immunoprecipitation (co-IP) Protocol - Mandarin
共免疫沉淀（Co-IP）方案
免疫共沉淀（Co-IP）完整中文方案，含 IP 裂解缓冲液与 RIPA 缓冲液配方、分步操作流程，以及裂解液制备、抗体选择与缓冲液优化的实用提示。
← 返回中文资源中心1简介
共免疫沉淀（Co-IP）用于从全细胞裂解物中分离靶蛋白及其结合伴侣。将裂解物与蛋白质特异性抗体进行孵育，再使用蛋白 A/G 偶联的琼脂糖珠将抗体/抗原复合物从样品中拉出，从而分离出目标蛋白。随后通过离心从琼脂糖珠中分离出目的蛋白，并用蛋白质印迹进行分析。
以下内容涵盖进行免疫共沉淀（Co-IP）所需的全部缓冲液与溶液、优化方案，以及获得理想 IP 结果的提示与技巧。
2缓冲液和溶液
2.1 IP 裂解缓冲液
- 50 mM HEPES，pH 7.5
- 150 mM NaCl
- 1 mM EDTA
- 5 mM EGTA
- 1%（w/v）Tween 20
- 1 mM 二硫苏糖醇（DTT）
- 1 mM NaF
- 100 µM PMSF
2.2 RIPA 缓冲液
- 1% v/v NP-40
- 20 mM Tris-HCl，pH 7.4
- 5 mM 焦磷酸钠
- 5 mM EDTA
- 新鲜加入的蛋白酶抑制剂（亮抑酶肽、PMSF、磷酸酶抑制剂）
3共免疫沉淀（Co-IP）方案
用于从全细胞提取物中分离蛋白质的免疫共沉淀方案：
- 通过以 400×g 离心 3 分钟收集细胞。
- 吸去培养基。
- 将细胞重悬于 500 µl IP 裂解缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM EDTA、2.5 mM EGTA、0.1%（w/v）Tween 20、1 mM 二硫苏糖醇、1 mM NaF 和 100 µM PMSF）或 RIPA 缓冲液中，置于冰上 15 分钟。
- 将细胞超声处理 2 次，每次 10 秒，随后立即放回冰上。
- 在 4°C 下以 10,000×g 离心 10 分钟。
- 将上清液转移至新的冷 Eppendorf 管中。
- 通过 Bradford 分析测定蛋白质浓度（见下文）。
- 将 1–2 mg 蛋白质加入含 20 µl A/G 琼脂糖珠和 2 µg 兔或小鼠 IgG 对照抗体的新鲜 Eppendorf 管中，以预清全细胞提取物。
- 在 4°C 下旋转样品 1 小时。
- 在 4°C 下以 1000×g 离心 1 分钟，沉淀与 IgG 结合的 A/G 琼脂糖珠。
- 弃去珠沉淀，保留上清液用于免疫沉淀。
- 将上清液转移至含兔或小鼠 IgG 对照抗体（2 µg）或相关抗体（2 µg）加 A/G 琼脂糖珠（40 µl）的新鲜 Eppendorf 管中。
- 使用 IP 裂解缓冲液将样品体积补足至 500 µl。
- 将样品在 4°C 下旋转过夜以收集免疫沉淀的蛋白质。
- 在 4°C 下以 1000×g 离心 1 分钟，沉淀与抗体结合的 A/G 琼脂糖珠。
- 吸去上清液。
- 将珠子重悬于 1 ml IP 裂解缓冲液或 RIPA 缓冲液中，并在 4°C 下以 1000×g 离心 1 分钟。
- 重复步骤 6 三次，以洗去非特异性结合的蛋白质。
- 将珠子重悬于 6X Laemmli 缓冲液中。
- 在 100°C 下煮沸 1 分钟。
- 立即通过 SDS-PAGE 和蛋白质印迹进行分析，或在 –20°C 下保存至分析。
4免疫共沉淀帮助提示
4.1 裂解液制备
用于共免疫沉淀的裂解液的质量将决定测定是否成功。使用正确的裂解缓冲液可以大大提高裂解液的质量。理想的裂解缓冲液应稳定天然蛋白质构象、抑制酶活性、防止变性，最重要的是确保蛋白质从细胞或组织中的最大释放。与 SDS 和脱氧胆酸钠等离子型洗涤剂相比，NP-40 和 Triton X-100 等非离子型洗涤剂的刺激性较小。变性缓冲液（例如放射免疫沉淀法 RIPA）非常适合难以释放的蛋白质（例如核蛋白）。
如果目标蛋白可以通过物理破坏（例如机械均质化或加热）从细胞中释放出来，则也可以使用无洗涤剂的缓冲液。
4.2 预清除裂解液
在开始进行免疫共沉淀之前，先用珠状载体预先清除裂解液，有助于去除可能与珠粒成分非特异性结合的任何潜在反应性成分。该预清除步骤也可以使用与捕获抗体具有相同来源和同种型的非特异性抗体来进行。此过程将去除在共免疫沉淀过程中可能与捕获抗体非特异性结合的任何物质，最终结果是降低背景并改善信噪比。
4.3 抗体的选择
选择正确的抗体进行纯化至关重要，因为它可以改变蛋白质的产量。多克隆抗体非常适合结合目标蛋白，因为它们可以结合目标蛋白上的多个表位，并形成保留率更高、结合更紧密的免疫复合物。将多克隆捕获抗体与单克隆检测抗体结合使用，可以在保证最大捕获功效的同时获得高检测特异性。
4.4 洗涤缓冲液的选择
用于共免疫沉淀测定的洗涤缓冲液应减少非特异性蛋白质结合并保持所需的蛋白质相互作用。PBS 和 TBS 是常用的洗涤缓冲液，因为它们具有生理浓度的盐和 pH 值。在某些情况下，可以适度调整洗涤缓冲液的盐浓度以减少背景。
如果使用上述洗涤缓冲液检测到非特异性相互作用，则可通过增加氯化钠浓度来提高严格程度。少量的还原剂（例如 1–2 mM DTT 或 β-巯基乙醇）可以帮助破坏非特异性相互作用。
4.5 洗脱缓冲液的选择
洗脱缓冲液的强度和 pH 值可确保正确洗脱目标蛋白。如果要通过 SDS-PAGE 或蛋白质印迹将免疫沉淀的样品进行进一步分析，则理想的方法是在运行缓冲液中洗脱。也可以选择在较温和的缓冲液（0.1 M 甘氨酸，pH 2.5）中洗脱，并在上样至 SDS-PAGE 凝胶之前进行中和。
5Bradford 蛋白测定法
- 将每种蛋白质样品的等分试样（2 ml）加入 96 孔板的单独孔中。
- 向每个样品中加入 Bradford 试剂（100 ml）。确保不引入气泡。
- 在室温下轻轻摇动 5 分钟。
- 要计算每个样品中的蛋白质浓度，需读取 BSA 标准曲线的吸光度：在 2 mg/ml 到 15 mg/ml 之间制备一系列 BSA 稀释液，并加入 96 孔板中的 100 ml Bradford 试剂。
- 测量 595 nm 处的吸光度，并在 Pro-Max5 酶标仪上针对空白（2 ml 裂解缓冲液，100 ml 染料试剂）在 450 nm 处的参考值进行标准化。
- 可根据标准曲线计算蛋白质样品的浓度。