共免疫沉淀是为了从全细胞裂解物中分离靶蛋白及其结合伴侣而进行的。将裂解物与蛋白质特异性抗体进行孵育。使用蛋白A/G偶联的琼脂糖珠将抗体/抗原复合物从样品中拉出，从而分离出目标蛋白。然后通过离心从琼脂糖珠中分离出目的蛋白，并用蛋白质印迹分析。

可以从以下找到进行免疫共沉淀（Co-IP）所需的所有缓冲液和溶液、优化方案以及达到完美IP的提示和技巧。

• 50 mM HEPES, pH 7.5
• 150 mM NaCl
• 1 mM EDTA
• 5 mM EGTA
• 1% (w/v) Tween 20,
• 1mM 二硫苏糖醇
•  
• 1 mM NaF
• 100 µM PMSF

• 1% v/v NP-40
• 20mM Tris-HCL pH 7.4
• 5mM 焦磷酸钠
• 5mM EDTA
• 新鲜加入的蛋白酶抑制剂（亮抑酶肽、PMSF、磷酸酯酶抑制剂）。

用于共免疫沉淀的裂解液的质量将决定测定是否成功。使用正确的裂解缓冲液可以大大提高裂解液的质量。理想的裂解缓冲液应稳定天然蛋白质构象，抑制酶活性，防止变性。最重要的是确保蛋白质从细胞或组织中的最大释放。与SDS和脱氧胆酸钠等离子型洗涤剂相比，NP-40和Triton X-100等非离子型洗涤剂的刺激性较小。变性缓冲液，例如放射免疫沉淀法（RIPA）的使用非常适合难以释放的蛋白质（例如核蛋白）。

如果目标蛋白可以通过物理破坏（例如机械均质化或加热）从细胞中释放出来，则也可以使用无洗涤剂的缓冲液。永远记住，一旦发生细胞裂解，蛋白水解、去磷酸化和变性就会开始。通过将样品始终置于冰上或4°C下，以及向裂解缓冲液中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂，可以减缓此速度。

在开始进行免疫共沉淀之前，先用串珠状载体预先清除裂解液，有助于去除可能与珠粒成分非特异性结合的任何潜在反应性成分。该预清除步骤也可以使用与捕获抗体具有相同来源和同种的非特异性抗体来进行。此过程将去除在共免疫沉淀过程中可能与捕获抗体非特异性结合的任何物质。最终结果将是降低背景并改善信噪比。

选择正确的抗体进行纯化至关重要，因为它可以改变蛋白质的产量。多克隆抗体非常适合结合目标蛋白，因为它们可以结合目标蛋白上的多个表位，并形成具有更高保留率的更紧密的结合免疫复合物。将多克隆捕获抗体和单克隆抗体结合起来进行检测，可以保证最大的捕获功效，检测特异性高。还应注意，使用识别一抗重链和轻链的二抗用于IP样品的蛋白质印迹检测将始终产生两个条带（50kDa的重链和25kDa的轻链） 。

用于共同免疫沉淀测定的洗涤缓冲液应减少非特异性蛋白质结合并保持所需的蛋白质相互作用。PBS和TBS是常用的洗涤缓冲液，因为它们具有生理浓度的盐和pH值。在某些情况下，可以适度调整洗涤缓冲液的盐浓度以减少背景。

如果使用上述洗涤缓冲液检测到非特异性相互作用，则可通过增加氯化钠浓度来提高严格程度。少量的还原剂（例如1-2mM DTT或β-巯基乙醇）可以帮助破坏非特异性相互作用。

洗脱缓冲液的强度和pH值可确保正确洗脱目标蛋白。如果要通过SDS-PAGE或蛋白质印迹将免疫沉淀的样品进行进一步分析，则理想的方法是在运行缓冲液中洗脱。也可以选择在较温和的缓冲液（0.1M甘氨酸，pH 2.5）中洗脱并在上样至SDS-PAGE凝胶之前进行中和。