1免疫组织化学指南——引言

免疫组织化学（IHC）是一种在组织学和病理学实验室中广泛使用的技术。IHC 能够视觉检测组织中的蛋白质和其他抗原，从而提供了一种检测异常细胞或生物样品中表征蛋白质的方法。

尽管 IHC 被认为比其他免疫测定（如 ELISA 或蛋白质印迹）的定量性要低，但 IHC 能够在完整组织的背景下定位蛋白质表达，因此提供了评估疾病（如癌症）进展和治疗选择的手段。

IHC 取决于所用抗体的特异性。高度特异性的抗体将确保目标蛋白在组织切片中的结合。可以使用显色或荧光检测实现抗体-抗原相互作用的可视化。显色检测依赖于与酶偶联的抗体的使用，该酶切割其底物以在蛋白质的位置产生有色产物。相比之下，对于荧光检测，所使用的抗体与荧光团偶联，可以使用荧光显微镜将其可视化。

1.1 抗体选择

选择正确的单克隆或多克隆一抗是成功、特异性地进行 IHC 检测的关键。每种检测方法都有各自的优缺点。单克隆抗体是由来自一只动物的单个 B 细胞克隆产生的，产生了针对单一表位的同质免疫球蛋白群体。多克隆抗体是由多个 B 细胞克隆产生的，从而形成针对同一抗原不同表位的异质抗体混合物。

单克隆抗体更受青睐，因为从建立的杂交瘤细胞系产生的批次允许标准化，并且群体是相同的。此外，已显示单克隆抗体的使用限制了背景染色并导致与其他蛋白质的交叉反应降低。使用多克隆抗体可以帮助增加抗原的检测信号，是处理变性蛋白质时的首选。由于多克隆抗体可以识别多个表位，因此与单克隆抗体相比，它们也更能耐受固定和加工过程中的微小变化。

选择用于 IHC 的抗体时应考虑物种选择。为了确保低背景，所用的二抗应针对所用一抗的宿主物种。

表 1：IHC 分析组成部分和注意事项

• 抗原——物种抗原表达水平
• 抗原修复——PIER 或 HIER
• 封闭剂——正常血清、蛋白质、商业缓冲液、其他
• 检测方法——直接/间接
• 固定剂——甲醛、酒精、丙酮
• 标签——荧光染料或色原
• 一抗——单克隆或多克隆
• 二抗——种类和检测标签
• 可视化和分析——荧光/光学显微镜、软件分析

2样品制备

正确的样品制备是高质量 IHC 染色的重要组成部分，涉及以下几个关键步骤。

2.1 样品固定

IHC 分析的第一步是样品收集。正确的样品采集对于避免自切组织的自溶和坏死至关重要。影响 IHC 分析样品质量的因素包括固定时间和样品温度。因此，建议尽快将样品放入固定液中。

固定可通过蛋白质碱性氨基酸残基之间的亚甲基桥和席夫碱交联来确保样品的保存、抗原的固定和亚细胞结构的维持。建议使用优化的固定方案，因为不合适的固定可能导致抗原无法再被检测到。

取决于所研究的抗原，可以使用不同的固定剂。IHC 使用最广泛的固定剂是 10% 中性缓冲福尔马林。其他固定剂包括可用于固定和透化膜的甲醇、乙醇和丙酮。下表概述了针对组织中选定抗原的推荐固定方案。

表 2：用于特定抗原的推荐固定液

• 血液形成器官/结缔组织——Zenker 氏或 Helly 氏溶液
• 脆弱的组织——Bouin 氏固定液
• 免疫球蛋白——冰冷的丙酮或甲醇（100%）
• 核形态学——福尔马林锌
• 核酸——Carnoy 氏溶液
• 蛋白质、肽和酶——10% 中性缓冲福尔马林
• 小分子——4% 甲醛

3嵌入

嵌入是样品制备的重要组成部分，可以保留形态并在加工和切片过程中提供组织支持。像固定一样，可以根据抗体的具体要求使用各种嵌入化合物。冷冻嵌入和石蜡嵌入是使用最广泛的方法，每种方法都有不同的优缺点，具体取决于所使用的抗体。

3.1 冷冻组织

与石蜡嵌入的切片相比，冷冻的组织切片可以在更短的时间内进行处理。通过将组织浸入液氮、异戊烷中或在干冰中速冻来制备冷冻的组织样品。冷冻样品在冷冻和切片后需要短暂固定，这通常用酒精来完成。与甲醛不同，酒精不会掩盖抗原决定簇，因此不需要在酒精固定的组织上进行抗原修复。

因为细胞内冰晶的形成可能会对亚细胞细节产生负面影响，不建议长期保存冷冻的组织切片。建议的冷冻切片最大储存限度为 –80℃ 下 1 年。

应当注意，冷冻切片通常比石蜡切片厚，这可能导致较低的显微分辨率和较差的组织形态图像。由于冷冻组织通常保留酶活性，因此内源酶的活性可能会影响 IHC 检测方法。

3.2 石蜡嵌入组织

石蜡嵌入是组织样品长期保存的最佳选择。通常使用显微刀将石蜡切片切成 3–5 µm。

在将样品嵌入到石蜡中之前，必须先对其进行固定，这可以在解剖后直接通过灌注或浸入完成，通常需要 4–24 小时。不要将样品固定超过 24 小时，因为过度固定可能会掩盖抗原。固定的持续时间可能需要优化，并且可以根据组织和抗原而变化。

由于石蜡不能与水混溶，因此在添加石蜡之前必须将组织样品脱水。样品可以通过浸入浓度越来越高的酒精中进行脱水，酒精浓度的逐渐增加可最大程度地减少细胞损伤。一旦在乙醇中完成脱水，将样品置于二甲苯中以除去任何残留的乙醇。

将石蜡加热到 60℃ 进行嵌入，并使其过夜硬化。然后，可以使用显微刀将组织切成薄片。这些组织切片可以在室温下保存，直到补液并开始 IHC 方案。

3.3 石蜡嵌入与冷冻嵌入的优缺点

石蜡嵌入组织

• 优点：保留组织形态
• 缺点：过度固定会掩盖表位
• 下游分析：PCR 扩增
• 固定：预嵌入
• 注意事项：组织加热的持续时间和强度可能对抗原有害
• 切片：显微刀
• 储存：室温下数年

冷冻组织

• 优点：保留酶和抗原功能
• 缺点：冰晶的形成会影响组织结构
• 下游分析：DNA、RNA、FISH 和细胞周期分析
• 固定：前/后切片
• 注意事项：快速冻结，不要直接在冷冻状态下切片
• 切片：低温恒温器
• 储存：–80℃ 下一年

4抗原修复

样品固定的过程尽管对于组织保存来说是必需的，但它可以掩盖目的表位，从而阻止一抗的结合。因此，抗原修复是指逆转表位掩盖并恢复表位-抗体结合的所有技术。抗原修复的作用是破坏固定引起的交联并暴露抗原。

在石蜡嵌入的组织上，有必要在抗原修复之前用二甲苯和酒精进行去石蜡步骤。去石蜡通常的步骤包括在二甲苯中洗涤 2 次，然后在 100%、95% 和 70% 乙醇中各洗涤 3 分钟。要完成补液过程，应将切片在 ddH₂O 中洗涤两次，每次 5 分钟。

有两种常见的抗原修复过程：

• 热介导——热诱导表位修复（HIER）
• 酶消化——蛋白水解抗原修复（PIER）

4.1 热诱导表位修复——HIER

HIER 使用热量来揭露表位。热量来源可以是微波炉、高压锅、蒸锅、水浴锅或高压釜。

4.2 蛋白水解抗原修复——PIER

该方法使用诸如蛋白酶 K、胰蛋白酶和胃蛋白酶之类的酶来恢复抗体与其表位的结合。使用酶促消化试剂时，重要的是不要过度消化或消化不足——应优化消化时间。使用 PIER 时应格外小心，因为在某些情况下，PIER 修复免疫反应的成功率较低，并且会破坏组织形态和目标抗原。

4.3 HIER 与 PIER 的比较

HIER

• 优点：维持表位
• 缓冲液组成：柠檬酸钠缓冲液、EDTA（pH 8.0）、Tris-EDTA
• 孵育时间：10–20 分钟
• pH 值：最广泛使用的 pH 值为 6，最佳 pH 值可能会有所不同
• 注意事项：加热会导致抗原修复不均
• 推荐抗原：无特异性抗原
• 温度：95℃

PIER

• 优点：常用于难以修复的表位
• 缓冲液组成：中性缓冲液，用于胃蛋白酶、蛋白酶 K 或胰蛋白酶等酶
• 孵育时间：5–30 分钟
• pH 值：pH 7.4
• 注意事项：酶活性可能会损坏样品
• 推荐抗原：免疫球蛋白、细胞角蛋白
• 温度：37℃

5渗透

某些样品可能需要进行渗透，以便抗体能够进入细胞内部检测蛋白质。如果表位位于细胞质区域，也需要渗透来检测跨膜蛋白。

使用溶剂或清洁剂可实现渗透。用交联剂（如多聚甲醛）固定后，可使用丙酮和甲醇等溶剂。建议将溶剂用于细胞骨架、病毒和酶抗原。清洁剂在样品上的作用温度通常要低得多，并且不会溶解质膜。诸如 Triton 或 Tween 20 之类的清洁剂用于透化细胞质、质膜中的抗原或用于可溶性核抗原。

6封闭

IHC 样品的封闭对于获得良好的 IHC 信号并降低信噪比至关重要。封闭不足会导致高水平的背景噪声，而封闭过多则会掩盖信号。

必要时，在样品固定、嵌入、抗原修复和渗透后进行封闭，这是在与一抗孵育之前的最后一步。封闭的时间长短取决于样品，从 30 分钟到过夜不等，可以在 4℃ 或室温下进行。在 IHC 分析中，使用不与目标表位或抗体特异性结合的蛋白质进行封闭。下面概述了最常用的封闭方法。

6.1 封闭血清

正常血清的使用被认为是最有效的封闭剂之一，并且使用来自产生二抗的相同物种的正常（非感染）血清进行。正常血清中的抗体会结合样本中的任何非特异性表位，并反过来阻止未结合的抗体。使用多克隆抗体时，正常血清是理想的封闭剂。

6.2 蛋白质缓冲液

可以使用蛋白质缓冲液代替血清来封闭样品。蛋白质缓冲液会与抗体竞争结合非特异性抗原决定簇，因此使用高浓度的蛋白质竞争剂可以与抗体竞争，从而最终降低背景噪音。常用的蛋白质封闭缓冲液为 0.1 至 0.5% 的牛血清白蛋白（BSA）、明胶或脱脂奶粉。

6.3 商业混合缓冲剂

也可以使用商业封闭缓冲液。

6.4 生物素封闭

如果使用抗生物素蛋白-生物素检测系统，建议在添加二抗之前先封闭内源性生物素。

6.5 过氧化物酶封闭

如果使用 HRP 偶联抗体，由于组织中已经存在内源性过氧化物酶，则可能会发生非特异性染色。通过用 DAB 底物孵育样品可以鉴定样品中是否存在过氧化物酶，DAB 底物会在过氧化物酶鉴定时变成棕色。为了阻断过氧化物酶，常用 H₂O₂。

6.6 碱性磷酸酶（AP）封闭

当使用 AP 色原基质时，内源性碱性磷酸酶（AP）可产生高背景。内源性 AP 通常存在于肾脏、肠道、骨细胞、淋巴和胎盘组织中。组织可以通过 BCIP/NBT 孵育来检测内源性 AP，如果观察到蓝色，则说明内源性 AP 存在，需要进行封闭。内源性 AP 可以通过在色原基质中加入左旋咪唑来封闭。

7免疫染色

成功制备样品后，可将组织与所选抗体一起孵育以检测目标抗原。有多种标记技术可用，例如直接标记、间接标记和间接带信号放大标记。

直接标记使用直接偶联至信号源的一抗，而间接标记具有产生信号的二抗，该信号将附着在与抗原接触的一抗上。直接检测比间接检测更快、更简单，因为标记通过共价键直接连接到一抗上，这意味着只需要一个孵育步骤和一轮洗涤。

需要注意的是，从小鼠产生的一抗将使用抗小鼠并与检测探针结合的二抗来检测。最后，使用生物素化的二抗和扩增试剂（如链霉亲和素）来完成间接带信号放大技术。

7.1 直接与间接免疫染色的比较

直接免疫染色

• 直接偶联抗体的数量有限
• 信号放大较低
• 没有物种交叉反应
• 无非特异性结合
• 步骤更少
• 易于实现双重染色

间接免疫染色

• 仅需少量标准偶联抗体
• 信号放大强
• 常用技术
• 可能发生非特异性结合
• 需要额外的孵育和洗涤步骤
• 双重染色较难实现

7.2 一抗

选择一抗时，请考虑其对所选抗原的特异性及其对 IHC 的适用性。设计用于蛋白质印迹或 ELISA 分析的抗体可能并不总是适用于已在固定组织中交联的目标抗原。因此，在商业抗体数据表上识别 IHC 适用性的示例至关重要。

一抗可以在同一培养液中用于多个目标，只要它们的宿主来源不同，即可用不同的二抗进行检测。

7.3 二抗

应根据对一抗的特异性选择二抗。例如，在兔中产生的一抗需要抗兔的二抗。可以通过使用与对比性荧光团相连的二抗来评估多种抗原，并根据宿主来源区分一抗。二抗孵育应在黑暗中进行，以保护荧光团。

同样重要的是，二抗的同种型与一抗相匹配。亲和纯化的抗体被广泛使用，因为它们提供了最低量的非特异性结合。但需要注意的是，IgG 部分尽管可能包含非常高亲和力的抗体，当抗原表达不佳或丰度低时可能会有用。

8复染和封片

复染可用于鉴定样品中所有不表达目标抗原的细胞。可以使用苏木精或 DAPI 进行复染。

要将盖玻片封装到载玻片上，请使用指定用于荧光显微镜的封片介质以帮助保留样品中的荧光信号。用足够的封片介质涂抹盖玻片，注意除去会扭曲或遮盖图像的气泡。

9IHC 对照

像所有其他测定一样，IHC 需要设置对照以确认染色模式准确可靠。对于 IHC，建议同时进行抗原对照和试剂对照。

抗原对照——应该同时有阳性和阴性抗原对照。阳性对照可以是已知表达要研究蛋白质的组织；阴性对照是已知不表达目的蛋白质的组织。使用阴性对照将有助于识别非特异性结合和假阳性。

试剂对照——试剂对照用于确保染色是由对抗原染色的一抗产生的，而不是由检测系统或样品产生的。可以使用仅含稀释剂而无一抗的检测系统来确定。

对于每个实验，还建议包括与非特异性同种型对照抗体一起孵育的组织切片，该抗体与一抗的类别和类型相匹配（如果一抗是单克隆抗体），但不能识别靶表位。同型对照有助于区分非特异性背景荧光和靶抗原的特异性荧光标记。如果一抗是多克隆抗体，请包括与非特异性、物种匹配的多克隆抗体一起孵育的组织切片。

10IHC 缓冲液配方

10.1 固定缓冲液

Zenker 氏溶液

• 氯化汞——5 g
• 重铬酸钾——2.5 g
• ddH₂O——100 mL

Helly 氏溶液

• 氯化汞——5 g
• 重铬酸钾——2.5 g
• ddH₂O——100 mL

Bouin 氏固定液

• 苦味酸（饱和）——75 mL
• 甲醛（37–40%）——25 mL
• 冰醋酸——5 mL

Carnoy 氏溶液

• 乙醇（100%）——60 mL
• 氯仿——30 mL
• 冰醋酸——10 mL

福尔马林锌（1. 0.1 M Tris 缓冲液，pH 7.4）

• Trizma Tris 碱——12.1 g
• 1 N HCl——81.5 mL
• 蒸馏水——900 mL

福尔马林锌（2. 锌固定液）

• 醋酸钙——0.5 g
• 醋酸锌——5.0 g
• 氯化锌——5.0 g
• 0.1 M Tris 缓冲液（见上文）——1000 mL

4% 甲醛固定液（1. 0.2 M 磷酸盐缓冲液，pH 7.4）

• Na₂HPO₄——21.8 g
• NaH₂PO₄——6.4 g
• ddH₂O——1000 mL

4% 甲醛固定液（2. 0.1 M 磷酸盐缓冲液，pH 7.4）

• 0.2 M PB——500 mL
• ddH₂O——500 mL

4% 甲醛固定液（3. 在 0.1 M 磷酸盐缓冲液中制作 4% 多聚甲醛）

• 聚甲醛——40 g
• 0.1 M 磷酸盐缓冲液——1000 mL

10% 中性缓冲福尔马林

• 福尔马林（37–40% 的原液）——100 mL
• ddH₂O——900 mL
• NaH₂PO₄（单碱基）——4 g/L
• Na₂HPO₄（二盐基/无水）——6.5 g/L

10.2 热诱导表位修复（HIER）缓冲液

柠檬酸钠缓冲液（10 mM 柠檬酸钠，0.05% Tween 20，pH 6.0）

• 柠檬酸三钠（二水合物）——2.94 g
• ddH₂O——1000 mL
• Tween 20——0.5 mL

Tris-EDTA 缓冲液（10 mM Tris 碱，1 mM EDTA，0.05% Tween 20，pH 9.0）

• Tris——1.21 g
• EDTA——0.37 g
• ddH₂O——1000 mL
• Tween 20——0.5 mL

10.3 酶法抗原修复缓冲液

胰蛋白酶原液（0.05%）

• 胰蛋白酶——50 mg
• ddH₂O——1000 mL

1% 氯化钙原液

• 氯化钙——0.1 g
• ddH₂O——1000 mL

胰蛋白酶工作液（0.05%）

• 胰蛋白酶原液（0.05%）——1 mL
• 氯化钙溶液（1%）——1 mL
• 蒸馏水——8 mL

10.4 渗透缓冲液

• Triton 或 NP-40——在 PBS 中使用 0.1–0.2%，持续 10 分钟（部分溶解核膜以进行核抗原染色）。
• Tween 20、皂素等——使用 0.2–0.5%，10–30 分钟（适用于细胞质抗原和可溶性核抗原）。

10.5 封闭缓冲液

过氧化物酶封闭液（PBS 中 3% H₂O₂，用于石蜡切片）

• 30% H₂O₂——10 mL
• 1X PBS——90 mL

过氧化物酶封闭液（甲醇中 3% H₂O₂，用于冷冻切片）

• 30% H₂O₂——1 mL
• 甲醇——99 mL

生物素封闭缓冲液

• PBS 中 0.001% 生物素

正常兔血清封闭缓冲液

• 兔血清——2%
• BSA——1%
• 冷鱼皮胶——0.1%
• Triton X-100——0.1%
• Tween 20——0.05%
• 叠氮化钠——0.1%
• 1 M PBS，pH 7.2

通用封闭缓冲液

• BSA——1%
• 冷鱼皮胶——0.1%
• Triton X-100——0.05%
• 叠氮化钠——0.05%
• 0.01 M PBS，pH 7.2–7.4