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RIPA Buffer Recipe - Mandarin

放射免疫沉淀分析 缓冲液配方

放射免疫沉淀分析(RIPA）缓冲液主要用于进行蛋白质印迹或免疫沉淀检测。使用RIPA缓冲液来裂解细胞，并从培养的细胞中提取蛋白质。细胞裂解RIPA缓冲液可以用来测定蛋白质浓度。因为含有三种非离子和离子洗涤剂，RIPA缓冲液是一种理想的细胞裂解试剂。

减少变性

当需要保持蛋白质与蛋白质之间的相互作用或减少变性时，建议使用不含SDS（离子洗涤剂）或Triton X-100（非离子洗涤剂）的RIPA缓冲液配方。

防止蛋白溶解和去磷酸化

一旦开始裂解，蛋白质降解也随即开始。为了防止或者减缓这一过程，必须始终将样品置于冰上，并向RIPA裂解缓冲液中新鲜加入合适的蛋白酶抑制剂。

制备细胞裂解RIPA缓冲液所需材料

步骤 材料

1.

细胞——粘附或悬浮

2.

RIPA缓冲液——冰冷

3.

冰冷的PBS

4.

冰

5.

新鲜加入的蛋白酶抑制剂（载脂蛋白、亮抑酶肽、DTT和PMSF）

放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液配方

步骤 配方A

1.

1% v/v NP-40

2.

20mM Tris-HCL pH 7.4

3.

5mM 焦磷酸钠

4.

5mM EDTA

5.

新鲜加入的蛋白酶抑制剂（亮抑酶肽、PMSF、正钒酸钠）
步骤 配方B

1.

50mM Tris HCL pH 7.4

2.

50 mM NaCl

3.

2mM EDTA

4.

0.1% SDS

5.

新鲜加入的蛋白酶抑制剂（载脂蛋白、亮抑酶肽、DTT和PMSF）

使用RIPA缓冲液制备细胞裂解液

步骤 程序

1.

用冰冷的PBS清洗细胞

2.

抽吸PBS

3.

加入冰冷的RIPA缓冲液（大约每107个细胞1毫升）

4.

使用无菌移液管尖刮除板上的粘附细胞

5.

离心力和时间可以根据细胞类型改变。

6.

从离心机中取出，在冰上保存。

7.

吸取上清液到一个新的管中，并保持置于冰上，丢弃颗粒。

8.

用布拉德福德测定法、Lowry测定法或二辛可宁酸（BCA）确定蛋白质浓度。BSA可以作为一个标准使用

9.

因此，一旦确定了蛋白质浓度，样品就可以在-20℃或-80℃下冷冻或准备装入。

准备样品装入凝胶

步骤 程序

1.

将样品归一化到适当的浓度

2.

使蛋白质变性，以使用Lameli缓冲液检测抗体。

3.

在95℃下加热5分钟。

4.

将样品装入到丙烯酰胺凝胶中

Lameli缓冲液

Lameli缓冲液中含有β-2-巯基乙醇，其作用是减少二硫键，从而使蛋白质变性。此外，Lameli缓冲液还含有SDS成分，可提供凝胶电泳所需的负电荷，甘油可增加样品密度。