RIPA Buffer Recipe - Mandarin
1RIPA 缓冲液简介
放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液主要用于蛋白质印迹（Western blot）或免疫沉淀检测。它可裂解细胞、从培养细胞中提取蛋白质，所得裂解液可用于测定蛋白质浓度。由于同时含有非离子型与离子型洗涤剂，RIPA 是一种理想的细胞裂解试剂。
减少变性
当需要保持蛋白质-蛋白质相互作用或减少变性时，建议使用不含 SDS（离子型洗涤剂）或 Triton X-100（非离子型洗涤剂）的 RIPA 缓冲液配方。
防止蛋白降解与去磷酸化
一旦开始裂解，蛋白质降解也随即开始。为防止或减缓这一过程，必须始终将样品置于冰上，并向 RIPA 裂解缓冲液中新鲜加入合适的蛋白酶（及磷酸酶）抑制剂。
2所需材料
- 细胞——贴壁或悬浮
- RIPA 缓冲液——冰冷
- 冰冷的 PBS
- 冰
- 新鲜加入的蛋白酶抑制剂：抑肽酶（aprotinin）、亮抑酶肽（leupeptin）、DTT 与 PMSF
3RIPA 缓冲液配方
配方 A（NP-40 体系）
- 1% v/v NP-40
- 20 mM Tris-HCl，pH 7.4
- 5 mM 焦磷酸钠
- 5 mM EDTA
- 新鲜加入的蛋白酶/磷酸酶抑制剂：亮抑酶肽、PMSF、正钒酸钠
配方 B（含 SDS 体系）
- 50 mM Tris-HCl，pH 7.4
- 50 mM NaCl
- 2 mM EDTA
- 0.1% SDS
- 新鲜加入的蛋白酶抑制剂：抑肽酶（aprotinin）、亮抑酶肽、DTT 与 PMSF
4使用 RIPA 缓冲液制备细胞裂解液
- 用冰冷的 PBS 清洗细胞。
- 抽吸去除 PBS。
- 加入冰冷的 RIPA 缓冲液（约每 10⁷ 个细胞 1 mL）。
- 使用无菌移液器吸头刮下板上的贴壁细胞。
- 离心；离心力与时间可根据细胞类型调整。
- 从离心机取出后置于冰上保存。
- 将上清液吸取到新管中并保持在冰上，弃去沉淀。
- 用 Bradford 法、Lowry 法或 BCA 法测定蛋白质浓度，可用 BSA 作为标准品。
- 确定蛋白质浓度后，样品可于 –20℃ 或 –80℃ 冻存，或准备上样。
5准备样品上样（凝胶）
- 将样品归一化到适当的蛋白浓度。
- 使用 Laemmli 缓冲液使蛋白质变性，以便抗体检测。
- 在 95℃ 下加热 5 分钟。
- 将样品加载到丙烯酰胺凝胶中。
6Laemmli 缓冲液
Laemmli（Lameli）缓冲液中含有 β-巯基乙醇，可还原二硫键从而使蛋白质变性；此外还含有 SDS，为凝胶电泳提供所需的负电荷，而甘油则增加样品密度以便上样。