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Subcellular Fractionation Protocol - Mandarin

亚细胞分级分离方案

作者：Sean Mac Fhearraigh博士

从哺乳动物组织中分离出高纯度的核、胞质和线粒体部分，可以研究和鉴定不同的细胞蛋白和细胞器。亚细胞分级分离可用于在进行组学分析之前用于样品制备的多种细胞类型。下面描述的方案已设计和优化，用于使用蔗糖梯度从细胞中提取核、线粒体和细胞质的亚细胞分级分离。根据样品数量，此方案最多可能需要3-4小时才能完成。可以将该方案用作其他细胞样品亚细胞分级分离的起点，尽管可能需要更改缓冲液体积、均质化持续时间和强度等。

亚细胞分级分离方案的组成部分

1.组织的破裂和裂解

细胞分级分离的第一步是组织破坏和细胞裂解。这一步可以在最小程度破坏目标细胞组分的情况下，分解并打开细胞。可用于组织和细胞裂解的3种基本方法：

  1. 均质化，
  2. 声波处理，
  3. 渗透裂解。

使用的方法取决于细胞类型和目标亚细胞部分。动植物组织最常用的方法是均质化。这个过程涉及到使用机械均质器，其作用类似于杵和研钵/搅拌器，将组织打散并裂解细胞。为了破坏和裂解原核细胞，使用了超声处理。这一过程利用超声波破坏细胞膜。

当目标细胞（如红细胞）易受渗透压力时，可使用渗透裂解。

2.离心

在最初的细胞分裂和裂解之后，需进行离心分离。离心确保细胞成分沉淀在试管底部。在离心过程中，裂解物以一定的速度旋转，即RPM——每分钟旋转数。这种旋转在垂直于旋转轴的粒子上施加了一个力，称为RCF——相对离心力，表示为地球重力（xg）的倍数。离心机中装有离心管的部分称为离心机转子。离心机可以有许多种不同的转子。离心机转子有三种类型：固定角转子、摇摆桶式转子和垂直转子。

固定角转子和摇摆桶式转子最常用的。顾名思义，在固定角转子中，离心管是以固定的角度旋转的，这非常适合沉淀细胞和亚细胞成分。摇摆桶式转子使管随着转子旋转而垂直于旋转轴摆动，通常用于密度梯度离心方案。

3.差速离心

差速离心是在逐渐增加离心力的情况下对细胞裂解液进行的顺序离心，分离出大小和密度降低的细胞成分。细胞组分的分离基于它们在离心介质中的沉降速率，因此取决于细胞组分的大小和形状。

差速离心导致在每个离心步骤之后产生沉淀。沉淀包含大小和密度大致相同的细胞成分的混合物。在每个离心步骤之后，可以除去上清液并再次离心，就可以沉淀其他尺寸和密度较小的细胞组分。

慢性粒细胞白血病细胞系的生长与维持

该研究中使用的细胞系包括K562和LAMA84慢性骨髓性白血病细胞以及HeLa宫颈癌细胞。所有细胞系均由欧洲细胞培养物保藏中心（ECACC）提供。K562和LAMA84细胞悬浮于RPMI1640培养基中，该培养基中添加了2mM L-谷氨酰胺、青霉素（100µg/ml）、链霉素（100µg/ml）和胎牛血清（FBS）（10％（v/v））。HeLa细胞在补充有2mM L-谷氨酰胺、青霉素（100g/ml）、链霉素（100 µg/ml）和胎牛血清（FBS）（10％（v/v））的Dulbecco改良Eagles培养基中生长。细胞在37℃、CO2(5%)和O2(95%)下孵育。

线粒体分离——程序

步骤 程序

1.

在T175cm²组织培养瓶中培养K562细胞（1x107）。

2.

通过以270xg离心5分钟获取细胞。

3.

吸出上清液

4.

将细胞重悬于1ml冰冷的PBS中

5.

270xg离心。

6.

将沉淀重悬于300µl蔗糖细胞提取缓冲液（SCEB）中（请参见以下配方）

7.

让细胞在冰上平衡30分钟，然后通过25-G针破裂25次。

8.

在4°C下以2000xg离心3分钟。

9.

将含有完整线粒体和胞浆蛋白的上清液转移至新的微量离心管中。

10.

重悬未破碎的沉淀细胞100µl SCEB，并通过30G针X10进行进一步破碎。

11.

以2000xg离心细胞3分钟。

12.

重复滴定步骤

13.

合并含有线粒体和胞质的细胞部分。

14.

将剩余的破碎细胞和碎片沉淀重悬于RIPA缓冲液中，并保存在-20°C进行进一步分析。

15.

在4°C下以2000xg离心合并的线粒体和胞质蛋白3分钟，使未破碎的细胞和细胞核沉淀。

16.

每次重复两次，将上清液加入新鲜的eppendorf管中。

17.

在4°C下以7000xg离心上清液10分钟以沉淀整个线粒体。

18.

将线粒体沉淀重悬于SCEB缓冲液中，并在冰上放置10分钟

19.

将含有胞浆蛋白的上清液转移至新鲜的eppendorf管中。

20.

将线粒体部分以7000xg离心10分钟，然后在RIPA缓冲液中裂解。

21.

使用Bradford测定法确定蛋白质浓度

22.

将样品储存在-20°C下。

K562细胞核级分的分离——程序

步骤 程序

1.

在T175cm²组织培养瓶中培养K562细胞（5x107）。

2.

在置于冰上的2.5ml均质缓冲液（HB）中裂解细胞15分钟（请参见以下配方）

3.

等分细胞（500µl）到新鲜的微量离心管中

4.

通过25-G针进行X25破裂。

5.

在4°C下以600xg离心10分钟。

6.

除去含有线粒体和胞质蛋白组分的上清液

7.

将含有核部分的沉淀重悬于250µl HB中，并以600xg离心10分钟。

8.

除去并丢弃上清液。

9.

将沉淀重新悬浮在2.2M 蔗糖溶液中，该溶液包含1mM MgCl2和10mM Tris-HCl，pH 7.4，并在1ml2.2M蔗糖溶液中分层。

10.

使用SV-T55i转子以80000xg离心80分钟。

11.

离心后，倒出上清液并使用浸有乙醇的纸巾清洁离心机的侧面。

12.

将核沉淀重悬于200µlHB中

13.

以600xg离心10分钟，共2次，以除去任何可能的线粒体或胞质污染。

14.

将核沉淀重悬于RIPA缓冲液中。

15.

将样品储存在-20°C下。

蔗糖细胞提取缓冲液（SCEB）配方

步骤 程序

1.

300mM蔗糖

2.

10 mM Hepes, pH 7.4

3.

50 mM KCl

4.

5 mM EGTA

5.

5 mM MgCl2

蛋白酶和磷酸酶抑制剂

步骤 程序

1.

1mg/ml抑肽酶、亮抑酶肽、胃酶抑素

2.

25.5 mM NaF

3.

1 mM Na3Vo4

4.

20.5mMβ-甘油磷酸酯

5.

100 µM PMSF

均质缓冲液（HB）配方

步骤 程序

1.

0.25M蔗糖

2.

10mM Tris-HCL, pH 7.4

3.

5mM MgCl2

亚细胞分级分离的纯度和验证

分离的级分纯度可以使用免疫印迹法测定特定的蛋白质标记物，例如组蛋白H3（细胞核）和细胞色素氧化酶IV（CoxIV，线粒体）。来自同一起始样品的亚细胞级分纯度的验证可通过蛋白质印迹分析检查“管家”（HK）蛋白标记来确定。

使用SDS-PAGE分离蛋白质样品，并转移到硝酸纤维素膜上。然后可以使用选定的单克隆抗体（例如组蛋白H3，GAPDH或Cox IV）分别针对细胞核、胞质和线粒体HK级分探测该膜。为了使蛋白质可视化，需添加一个特定的二级HRP结合的抗体来暴露印迹。