Subcellular Fractionation Protocol - Mandarin
1简介
从哺乳动物组织中分离出高纯度的细胞核、胞质与线粒体组分，可用于研究和鉴定不同的细胞蛋白与细胞器。亚细胞分级分离可为多种细胞类型的样品制备（如组学分析前）提供支持。
以下方案经设计与优化，使用蔗糖梯度从细胞中提取细胞核、线粒体与细胞质组分。视样品数量而定，整个方案可能需要 3–4 小时。该方案可作为其他细胞样品亚细胞分级分离的起点，但可能需要调整缓冲液体积、均质化时间与强度等参数。
2方案原理与组成
2.1 组织的破裂与裂解
细胞分级分离的第一步是组织破坏与细胞裂解——在尽量少破坏目标细胞组分的前提下打开细胞。常用的三种基本方法为：
- 均质化——动植物组织最常用；使用机械均质器（类似杵与研钵/搅拌器）打散组织并裂解细胞。
- 超声处理——常用于破坏原核细胞，利用超声波破坏细胞膜。
- 渗透裂解——当目标细胞（如红细胞）易受渗透压影响时使用。
2.2 离心
裂解之后需进行离心以使细胞组分沉于管底。裂解物以一定转速（RPM，每分钟转数）旋转，对垂直于旋转轴的颗粒施加相对离心力（RCF，以地球重力 ×g 的倍数表示）。离心机中放置离心管的部件称为转子，常见有固定角转子、摇摆桶式转子与垂直转子三类。固定角转子以固定角度旋转，适合沉淀细胞与亚细胞组分；摇摆桶式转子使管随转子摆动至垂直于旋转轴，常用于密度梯度离心。
2.3 差速离心
差速离心是在逐步增大离心力的条件下对裂解物进行的顺序离心，依据细胞组分在离心介质中的沉降速率（取决于大小与形状）将其分离。每一步离心后产生的沉淀含有大小与密度相近的组分混合物；去除上清后再次以更高离心力离心，即可沉淀较小、较低密度的组分。
3细胞系的生长与维持
本方案中使用的细胞系包括 K562 与 LAMA84 慢性髓性白血病细胞，以及 HeLa 宫颈癌细胞（均由欧洲细胞培养物保藏中心 ECACC 提供）。K562 与 LAMA84 悬浮培养于 RPMI-1640 培养基中，添加 2 mM L-谷氨酰胺、青霉素（100 µg/ml）、链霉素（100 µg/ml）与 10%（v/v）胎牛血清（FBS）。HeLa 培养于同样补充的 DMEM 培养基中。细胞于 37℃、5% CO₂ 条件下培养。
4线粒体分离——方案
- 在 T175 cm² 培养瓶中培养 K562 细胞（1×10⁷）。
- 以 270×g 离心 5 分钟收集细胞。
- 吸去上清液。
- 将细胞重悬于 1 ml 冰冷 PBS 中。
- 270×g 离心。
- 将沉淀重悬于 300 µl 蔗糖细胞提取缓冲液（SCEB，配方见下）。
- 冰上平衡 30 分钟，再用 25-G 针破碎 25 次。
- 4℃、2000×g 离心 3 分钟。
- 将含完整线粒体与胞浆蛋白的上清转移至新离心管。
- 将未破碎的沉淀重悬于 100 µl SCEB，用 30-G 针破碎 10 次进一步裂解。
- 2000×g 离心 3 分钟。
- 重复上述滴定（破碎）步骤。
- 合并含线粒体与胞质的组分。
- 将剩余的破碎细胞与碎片沉淀重悬于 RIPA 缓冲液，–20℃ 保存以备进一步分析。
- 将合并的线粒体/胞质组分于 4℃、2000×g 离心 3 分钟，沉淀未破碎细胞与细胞核。
- 每次重复两遍，将上清加入新的 Eppendorf 管。
- 4℃、7000×g 离心上清 10 分钟以沉淀完整线粒体。
- 将线粒体沉淀重悬于 SCEB 缓冲液，冰上放置 10 分钟。
- 将含胞浆蛋白的上清转移至新的 Eppendorf 管。
- 将线粒体组分 7000×g 离心 10 分钟，再于 RIPA 缓冲液中裂解。
- 使用 Bradford 法测定蛋白质浓度。
- 样品于 –20℃ 保存。
5K562 细胞核级分的分离——方案
- 在 T175 cm² 培养瓶中培养 K562 细胞（5×10⁷）。
- 于冰上用 2.5 ml 均质缓冲液（HB，配方见下）裂解细胞 15 分钟。
- 分装细胞（500 µl）至新的离心管。
- 用 25-G 针破碎 25 次。
- 4℃、600×g 离心 10 分钟。
- 去除含线粒体与胞质蛋白组分的上清。
- 将含核组分的沉淀重悬于 250 µl HB，600×g 离心 10 分钟。
- 去除并弃去上清。
- 将沉淀重悬于含 1 mM MgCl₂ 与 10 mM Tris-HCl（pH 7.4）的 2.2 M 蔗糖溶液中，并在 1 ml 2.2 M 蔗糖溶液上分层。
- 使用 SV-T55i 转子以 80,000×g 离心 80 分钟。
- 离心后倒出上清，用蘸乙醇的纸巾清洁离心管/机侧壁。
- 将核沉淀重悬于 200 µl HB。
- 600×g 离心 10 分钟，共 2 次，以去除可能的线粒体或胞质污染。
- 将核沉淀重悬于 RIPA 缓冲液。
- 样品于 –20℃ 保存。
6缓冲液配方
蔗糖细胞提取缓冲液（SCEB）
- 300 mM 蔗糖
- 10 mM HEPES，pH 7.4
- 50 mM KCl
- 5 mM EGTA
- 5 mM MgCl₂
蛋白酶与磷酸酶抑制剂
- 1 mg/ml 抑肽酶、亮抑酶肽、胃酶抑素（pepstatin）
- 25.5 mM NaF
- 1 mM Na₃VO₄
- 20.5 mM β-甘油磷酸酯
- 100 µM PMSF
均质缓冲液（HB）
- 0.25 M 蔗糖
- 10 mM Tris-HCl，pH 7.4
- 5 mM MgCl₂
7纯度与验证
可通过免疫印迹检测特定蛋白标记物来评估各分离级分的纯度，例如组蛋白 H3（细胞核）与细胞色素氧化酶 IV（CoxIV，线粒体）。来自同一起始样品的各亚细胞级分纯度，可通过检测“管家”（housekeeping）蛋白标记加以验证。
用 SDS-PAGE 分离蛋白样品并转移至硝酸纤维素膜，随后用所选单克隆抗体（如组蛋白 H3、GAPDH 或 CoxIV）分别探测细胞核、胞质与线粒体级分；再加入相应的 HRP 偶联二抗以显色显示条带。