フローサイトメトリーによるマルチプレックスELISAの手順

マルチプレックスELISAの概要と原理

Genieplexマルチプレックスアッセイ技術であるELISA Genieは、サイズ毎に分けられた複数のビーズ集団と、異なるレベルの蛍光強度を利用します。各ビーズサイズに複数サイズのビーズと複数レベルの蛍光強度を用い、GeniePlex技術により一回の反応で同時に24検体を測定可能です。

反応時のビーズ集団は、シングル488nmレーザー光もしくはデュアル488nmと633/640nmレーザー光を装備したフローサイトメーターにより決定されます。ビーズ分類染色の最大放射は700nmで起きます。

ビーズ基準のイムノアッセイはサンドイッチELISAの原理に似ており、それぞれのビーズ集団がサイトカインのようなサンプル中の対象タンパク質に捕獲された特定の捕捉抗体と結びついています。キャプチャされた検体の量は、タンパク質の二次エピトープに対して作られたビオチン化抗体を通じて検知され、ストレプトアビジン-フィコエリスリン処理に続きます。ビーズ上のフィコエリスリンの蛍光強度がフローサイトメーターにより数値化されます。

サンプル中の対象タンパク質の濃度は、検体の判明している濃度を連続希釈して得られた標準カーブ曲線中の蛍光シグナルを比較することにより得られます。

アッセイ手順は、抗原と捕捉抗体が複合した60分間のビーズ培養ステップと、30分間のビオチン化検出培養ステップに、20分間のストレプトアビジンPE培養ステップからなります。

マルチプレックスELISAのビデオ手順

マルチプレックスELISAの手順概要

図1. 手順の概要:

1.) Genieplex抗体ビーズ複合体をウェルに追加する。2.) サンプルと標準試薬をウェルに追加する。室温にて60分間サンプルを培養する。次いでフィルタープレート真空システムを使いながらプレートを3回洗浄する。3.) ビオチン化抗体を追加し30分間培養する。次いでフィルタープレート真空システムを使いながらプレートを3回洗浄する。4.) ストレプトアビジンPE溶液を追加し20分間培養する。次いでフィルタープレート真空システムを使いながらプレートを3回洗浄する。5.) リーディングバッファ液を追加し。フローサイトメーターでサンプルを測定する。6.) データを分析する。

手順のステップ

番号

1. フィルタープレートテンプレートを準備する。標準試薬とサンプル、空欄ウェルをマークする。標準試薬とサンプルは二重または三重で実行される必要がある。もし全プレートが使用されないのであれば、プレートシールで使われていないウェルをシールする。

重要:プレートの底面がどんな表面にも触れることがないよう、全アッセイプロセスの間、フィルタープレートをフィルタープレート蓋の上部に置く。

2. 作業中のビーズ懸濁液を15秒間攪拌する。

3. 捕獲ビーズ作業懸濁液を45μLずつそれぞれのウェルに追加する。注意:残りの捕獲ビーズ作業懸濁液を保存し遮光しながら2〜8℃で保管する。これはフローサイトメーターのセットアップ時のパラメータ取得作業に使える。

4. フィルタープレート洗浄手順に則って調整された真空源に接続された”flow-through(流入式)”フィルタープレートウォッシャーを使用してウェル内の懸濁液を除去する。

5. プレートの底面をペーパータオル数枚に優しくタップして、懸濁液の”流入”除去後の残留懸濁液を除去する。

6. CCSとSPB、TLアッセイ懸濁液をそれぞれサンプルウェルに追加する。注意:細胞培養上清サンプルは、もし非常に低レベル(20 pg/mL未満)のサイトカインが見込まれる場合、アッセイバッファを希釈することなく実行することが出来る。この場合、このステップを飛ばして次のステップ7の各サンプルウェルに細胞培養上清サンプル45μLを追加する。

7. サンプル液15μLを各サンプルウェルに追加する。

8.標準試薬45μLを各標準ウェルに追加する。

9. プレートをプレートシールでカバーする。

10. シェーカー (700rpm回転にセット)で60分間室温にて培養する。フィルタープレートをアルミホイルで包み遮光保護する。

11. プレートシールを除去する。

12. フィルタープレートウォッシャーを利用しながら一回あたり100μLの洗浄バッファでウェルを3回洗浄する。

13. 最後の洗浄後、プレートの底面をペーパータオル数枚に優しくタップして、底面に残留したバッファを除去する。

14. 各ウェルに25μLのビオチン化抗体作業溶液を追加する。

15. プレートをプレートシールでカバーする。

16. シェーカー(700rpm回転にセット)で30分間室温にて培養する。フィルタープレートをアルミホイルで包み遮光保護する。

17.プレートシールを除去する。

18.フィルタープレートウォッシャーを使用してウェル内の溶液を除去する。

19. フィルタープレートウォッシャーを使用して一回あたり100μLの洗浄バッファで3回洗浄する。

20. 最後の洗浄後、プレートの底面をペーパータオル数枚に優しくタップして、底面に残留したバッファを除去する。

21. 各ウェルに25μLのストレプトアビジンPE作業溶液を追加する。

22. プレートをプレートシールでカバーする。

23. シェーカー(700rpm回転にセット)で20分間室温にて培養する。フィルタープレートをアルミホイルで包み遮光保護する。

24. プレートシールを除去する。

25. フィルタープレートウォッシャーを利用してウェル内の溶液を除去する。

26. 一回あたり100μLの洗浄バッファでウェルを2回洗浄する。

27. プレートの底面をペーパータオル数枚に優しくタップして、底面に残留したバッファを除去する。ビーズを再懸濁するためのフローサイトメーターのサンプル搭載メカニズムに応じて、150〜300μLのリ―ディングバッファを各ウェルに追加する。

28. プレートシールでプレートをカバーする。

29. マイクロタイターシェーカーにプレートを置き700rpmで30秒間振動させる。注意:もしフローサイトメーターに96ウェルプレートローダーがなく200μL以上のリーディングバッファがビーズの再懸濁のために必要な場合、プレートを振動させないこと。各ウェルのビーズを6〜8回P200ピペットを用いて上下にピペットすることで再懸濁させ、それから取得するためにテスト管に移送すること。

30. プレートシールを除去する。

31. フローサイトメーターの測定値を確認する。