フローサイトメトリーによるマルチプレックスELISAの手順
マルチプレックス ELISA · 日本語
フローサイトメトリーによるマルチプレックス ELISA の手順
ビーズベースのマルチプレックス ELISA（GeniePlex）の原理と、フローサイトメトリーを用いた測定プロトコルをステップごとに日本語でまとめました。
← 日本語リソースへ戻る1マルチプレックス ELISA の概要と原理
ヒトサイトカイン マルチプレックスアッセイは、サイズと蛍光強度で分けられた複数のビーズ集団を利用します。各ビーズにサイズと蛍光強度のレベルを組み合わせることで、GeniePlex 技術により 15 µL のサンプルから 24 検体を同時に測定できます。
ビーズ集団は、488 nm シングルレーザー、または 488 nm と 633/640 nm のデュアルレーザーを備えたフローサイトメーターで測定します（ビーズ判別用の最大蛍光波長は 700 nm）。
ビーズベースのイムノアッセイはサンドイッチ ELISA の原理に似ています。ビーズ上の捕捉抗体がサンプル中の対象タンパク質（サイトカインなど）を捕捉し、別エピトープを認識するビオチン標識抗体で挟み込み、ストレプトアビジン-フィコエリスリン（PE）と反応させます。ビーズ上の PE 蛍光強度をフローサイトメーターで数値化します。
測定対象タンパク質の濃度は、濃度既知の因子を連続希釈して得た標準曲線と蛍光シグナルを比較して求めます。アッセイは、抗原の捕捉（60 分）、ビオチン標識抗体の結合（30 分）、ストレプトアビジン PE の反応（20 分）のインキュベーションステップからなります。
2手順の概要
手順の概要（図1）
- GeniePlex 抗体標識ビーズをウェルに添加します。
- サンプルとスタンダードをウェルに添加し、室温で 60 分間インキュベートした後、フィルタープレート吸引システムで 3 回洗浄します。
- ビオチン標識抗体を加えて 30 分間インキュベートし、3 回洗浄します。
- ストレプトアビジン PE 溶液を加えて 20 分間インキュベートし、3 回洗浄します。
- リーディングバッファーを加え、フローサイトメーターで測定します。
- データを解析します。
3詳細プロトコル
詳細プロトコル
- フィルタープレートのテンプレートを準備し、スタンダード・サンプル・ブランクウェルをマークします。スタンダードとサンプルは 2〜3 反復で実施します。使用しないウェルはプレートシールで封をします。重要：アッセイ中はプレート底面が触れないよう、フィルタープレートをフタの上部に置きます。
- ビーズ懸濁液を 15 秒間ボルテックスし、捕捉ビーズ懸濁液を各ウェルに 45 µL ずつ添加します（残りは遮光して 2〜8℃ で保管。フローサイトメーターのセットアップに使用できます）。
- 真空源に接続した flow-through 式フィルタープレートウォッシャーでウェル内のバッファーを除去し、プレート底面をペーパータオルに軽くタップして残留を除きます。
- アッセイバッファー（CCS＝細胞培養上清／SPB＝血清・血漿・体液／TL＝組織・細胞ライセート）30 µL を各サンプルウェルに添加します。注：低レベル（20 pg/mL 未満）が見込まれる細胞培養上清では希釈せず、このステップを省略して次のステップでサンプル 45 µL を添加します。
- サンプル 15 µL を各サンプルウェルに、スタンダード 45 µL を各スタンダードウェルに添加します。
- プレートシールで覆い、シェーカー（700 rpm）で室温 60 分間インキュベートします（アルミホイルで遮光）。
- シールをはがし、フィルタープレートウォッシャーで 100 µL のウォッシュバッファーにより 3 回洗浄し、最後にプレート底面をタップして残留を除きます。
- 各ウェルにビオチン標識抗体溶液 25 µL を添加します。
- プレートシールで覆い、700 rpm・室温で 30 分間インキュベートします（遮光）。
- シールをはがし、ウェル内の溶液を除去して、100 µL のウォッシュバッファーで 3 回洗浄し、底面をタップします。
- 各ウェルにストレプトアビジン PE 溶液 25 µL を添加します。
- プレートシールで覆い、700 rpm・室温で 20 分間インキュベートします（遮光）。
- シールをはがし、溶液を除去して、100 µL のウォッシュバッファーで 2 回洗浄し、底面をタップします。
- フローサイトメーターのローディング機構に応じて、150〜300 µL のリーディングバッファーを各ウェルに添加してビーズを再懸濁します。
- プレートシールで覆い、マイクロタイターシェーカーで 700 rpm・30 秒間シェイクします。注：96 ウェルローダーがなく 200 µL 超のリーディングバッファーが必要な場合はシェイクせず、P200 ピペットで 6〜8 回ピペッティングして再懸濁し、テストチューブに移します。
- シールをはがし、フローサイトメーターで解析します。
すべての洗浄は flow-through 式フィルタープレートウォッシャーで行い、各ステップ後はプレート底面をペーパータオルに軽くタップして残留バッファーを除いてください。
4マルチプレックス ELISA パネル
目的に合わせて、各種マルチプレックス ELISA パネルをご用意しています。
5関連する日本語ガイド
ELISA ワークフローに役立つ、その他の日本語ガイドもあわせてご覧ください。