ELISA Assay, 원리, Protocols, 방법 및 Kits

ELISA assay는 무엇입니까?

ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay : 효소 결합 면역 흡착제 분석)는 생물학적 샘플에서 단백질, 펩타이드, 호르몬 또는 화학 물질의 수준을 측정하는 항체 기반 기술입니다. Sandwich ELISA 분석에서는 96 well plate표면에 포획 항체(capture antibody)를 붙이며, 여기에 분석하고자 하는 시료를 추가하면 항체와 시료 사이의 복합체가 형성됩니다.

배양단계 후, wash buffer를 사용해 well을 세척하여 결합되지 않은 분석물을 제거합니다. 다음으로, 검출을 위해서 효소와 결합할 수 있는 검출 항체 (detection antibody)를 첨가합니다. 인큐베이션 후, 여분의 항체 및 비특이적 결합된 단백질을 제거하기 위해 다시 한번 세척 단계가 수행됩니다. 다음으로 기질(substrate)을 추가하면 비색 변화가 발생합니다. 시료 내 분석물의 양은 색상 변화의 정도와 연관성을 나타냅니다. 마지막으로stop solution이 추가됩니다. 프로토콜이 완료되면 ELISA plate reader에서 샘플을 분석하고, 소프트웨어 프로그램을 사용하여 플롯하고 결과를 계산합니다

글쓴이 : Seán Mac Fhearraigh PhD

ELISA assay는 무엇입니까?

 
 

ELISA assay plate

ELISA 분석은 96 또는 384 well polystyrene plate에서 수행됩니다. 단백질과 항체는 배양 후 96 well ELISA plate에 고정됩니다. Sandwich ELISA 분석에서는 포획항체가 ELISA plate에 고정됩니다. 그러나 Competitive ELISA 분석에서는, 측정하고자 하는 분석물이 ELISA plate에 고정됩니다. 그 뒤 ELISA plate를 BSA blocking solution으로 차단하여 비특이적 단백질결합을 방지합니다.

항체 또는 분석물을 plate에 결합시킨 후, washing buffer로 세척 단계를 수행하여 비특이적 결합된 분석물을 제거할 수 있습니다.

ELISA plate를 바닥이 평평한곳에 놓고, ELISA plate reader로 450nm에서 흡광도를 측정합니다.

그림 : 96 well polystyrene ELISA plate의 그림

EIA vs ELISA

그림 1 : 분석물 포획 및 분석을 위한 검출법의 예 : EIA 형식(Western Blot) vs. Sandwich ELISA

면역 측정법 (Immunoassay)은 관심있는 항원을 검출하기 위해 항체를 사용하는 분석법입니다. EIA (Enzyme immunoassay : 효소 면역 분석)는 검출 및 정량화를 위해 검출 항체에 결합하는 효소를 사용하는 분석법입니다. EIA의 두 가지 예로는 Western Blot과 ELISA가 있습니다. Western Blot은 단백질을 고정시키기 위해 Nitrocellulose 또는 PVDF를 사용하는 EIA입니다. 단백질 고정 후, 이 단백질과 결합하는 일차 항체 (primary antibody)를 첨가하고, 검출을 위해enzyme conjugated-secondary antibody를 가해 인큐베이션 합니다. ELISA 분석에서는 포획 항체가 polystyrene plate에 고정되고, 관심 있는 분석물이 포함된 시료를 넣어 인큐베이션 한 다음, 검출 항체와 TMB를 기질로 사용한 비색 변화를 통해 결과를 측정합니다.

ELISA 분석의 민감도 및 범위

ELISA 분석을 통해, 연구자들은 표준물질을 사용하여 정의된 범위 내에서 샘플 (혈청, 혈장, 상층액, 우유, 소변 등 )에 포함된 분석물의 양을 확인할 수 있습니다. 샘플 내 분석물의 농도를 측정하기 위해, 이미 농도를 알고 있는 분석물을 기준으로 사용하며 이를 표준물질 (standard)이라고 합니다. ELISA 분석에서, 표준 용액(stock of the standard)이 대개 ng/ml 또는 pg/ml농도로 제공되며, 이 용액은 6-7배 희석되어 일정한 범위의 농도를 가진 분석물을 만드는데 이용됩니다. 이를 통해 표준 곡선이 생성되고, 샘플 내의 분석물 농도는 이 값과 비교하여 계산됩니다.

ELISA Assays의 종류

연구자들이 주로 사용하는ELISA 분석법에는 크게 6종류가있습니다. 가장 많이 사용되는 것으로 Sandwich ELISA assay, Competitive ELISA assay가 있고, 그 다음으로는 ELISpot assay, Indirect assay 가 있습니다.

ELISA 종류 설명

Sandwich ELISA assay

Sandwich ELISA 분석은 ELISA의 가장 일반적인 형태입니다. 이는 분석물을 포획항체와 검출항체 사이에 끼우는 형태를 따라 명명되었습니다. 위에서 언급했듯이, Sandwich ELISA 분석은 포획 항체를 polystyrene ELISA plate에 고정시킵니다. 샘플을 ELISA plate의 well에서 인큐베이션 한 다음 세척 단계를 거칩니다. Enzyme linked detection antibody를 첨가한 후, 다시 인큐베이션 단계를 거치고, 최종적으로 기질 및 stop solution을 첨가하여 분석물 농도를 측정합니다.

Competitive ELISA assay

Competitive ELISA 분석은 주로 호르몬을 검출하는 데 사용됩니다. Competitive ELISA 분석에서는 관심있는 분석물이 polystyrene ELISA plate에 고정되어 있습니다. Plate에 고정되어 있는 분석물과 샘플 내의 분석물이 포획 항체와 결합하기 위해 경쟁하는 과정을 따서 Competitive ELISA라고 명명되었습니다. 따라서, 샘플에서 분석물의 양이 증가하면 신호가 감소하고, Sandwich ELISA 분석에서 볼 수 있는 그래프와 반대가 됩니다.

ELISpot ELISA assay

EliSpot 분석은 백신 개발, 수의학 연구, 단핵구/대식세포/수지상 세포의 특성 분석에 일반적으로 사용됩니다. EliSpot의 원리는 Sandwich ELISA 분석과 유사하며, 플레이트는 포획 항체로 코팅됩니다. 세포는 ELISA 플레이트에서 최대 3 시간 동안 배양되며, 시간은 살험에 따라 달라질 수 있습니다. 세포에 의해 생성된 사이토카인이 ELISA 플레이트에 고정된 포획항체에 의해 결합됩니다. ELISA 플레이트에서 세포를 세척하고, 검출 항체를 첨가한 다음, 기질 및 stop solution으로 사이토카인을 검출할 수 있습니다.

FluoroSpot ELISA assay

FluoroSpot ELISA 분석은 EliSpot ELISA와 동일하지만, 효소와 연결된 검출 항체를 사용하는 대신, 검출 항체를 형광단(fluorophore)과 결합시켜 검출 및 분석이 가능합니다.

Indirect ELISA assay

Indirect ELISA 분석에서는 관심있는 분석물을 일차 포획 항체에 결합시킵니다.. 그런 다음 이 일차 항체에이차 항체를 결합시킵니다. 이는 Western Blot분석 방법과 유사합니다.

Direct ELISA assay

Direct ELISA 분석에서는, enzyme-labelled antibody가 용액 안의 분석물에 결합합니다. 결합이 생성되면, enzyme-labelled antibody는 기질과 반응하여 색 변화를 일으켜 분석물의 정량화를 가능하게 합니다. 이때 포획 항체가 두 기능을 모두 수행하므로 이차 검출 항체가 필요하지 않습니다.

Multiplex ELISA assay

Multiplex ELISA 분석을 통해 연구자들은 단일 샘플에서 여러 분석물을 분석할 수 있습니다. 이 기능은 연구자가 샘플에서 여러 사이토카인을 동시에 측정하려고 할 때 매우 유용합니다. Multiplex ELISA 분석은 flow cytometry, plate based multiplex, PVDF 또는 Nitrocellulose membrane 등 다양한 형식을 통해 수행할 수 있습니다.

CLIA assay

CLIA 분석은 원칙적으로 sandwich분석과 유사하지만, 샘플 검출을 위해 색소생산성 기질 (chromogenic substrate) 사용하는 대신 화학발광 (chemiluminescence)를 이용합니다. CLIA 분석에서 검출 항체는 기질을 빛으로 변환합니다. 생성된 광자의 양은 샘플 내 분석물의 양에 비례합니다. 발광 정도는 광도계 (luminometer)를 이용해 Relative Light Units(RLU)로 측정됩니다.

CLIA 분석은 일반적으로 저농도 분석 물질의 검출에 사용됩니다 (검출 한계 = zeptomole 10-21 mol).

In-Cell ELISA

In-Cell ELISA는 indirect ELISA 기법이며, polystyrene ELISA plate에서 밤새 배양된 세포를 이용합니다. 세포를 전처리(fixed, permeablilized, blocked)한 후, 효소와 결합시키거나(enzyme conjugated) 또는 형광 표지자를 붙인(fluorescently tagged) 일차 항체를 사용하여 표적 단백질을 검출합니다. 형광표지자를 붙인 항체는 fluorescent plate reader 또는 현미경으로 검출 가능하고, 효소 접합된 이차 항체는 plate reader로 검출할 수 있습니다.

ELISA Plate Map

ELISA 검사를 수행할 때는 결과를 분석할 수 있도록 ELISA 플레이트에 standard, blank, control 및 샘플을 배치하는 레이아웃이 중요합니다. 각 96 well ELISA plate은 연구자가 ELISA 리더기에서 한 번에 최대 40개의 샘플을 분석할 수 있도록 합니다.
대부분의 Sandwich & Competitive ELISA 키트에는 standard가 7-point dilution되어 있으므로, ELISA 플레이트의 14개 well을 standard에 사용됩니다. standard 외에도 sample/standard dilution buffer만 넣는 blank contol이 있어야 합니다. 또한 연구자들은 플레이트에 positive, negative 또는 splike recovery conrol를 위해 추가 well을 사용할 수 있습니다.

그림 1 : 실험 설계를 위한 ELISA plate map 예. 보라색 원=Standard, 회색 원=Sample, 흰색 원=Blanks

ELISA 샘플 준비 – Serum(혈청), Plasma(혈장), Lysate(용해물), 소변, 우유

ELISA 검사를 수행할 때는 최상의 결과를 얻기 위해 검체의 준비가 중요합니다. 아래는 다양한 샘플 유형에 대한 샘플 준비 절차 목록입니다.

샘플 종류 프로토콜

Serum(혈청)

Serum separator tubes(혈청 분리 튜브)를 사용하는 경우, 샘플을 실온에서 30분 동안 응고시킵니다. 1,000x g에서 10분간 원심분리합니다. 혈청 분획을 채취하여 즉시 분석하거나, 샘플을 분주하여 -80°C에 보관합니다. 동결-해동 사이클이 여러 번 반복되지 않도록 합니다.

Serum separator tubes를 사용하지 않는 경우, 샘플이 밤새 2-8°C에서 응고되도록 두십시오. 1,000x g에서 10분간 원심분리합니다. 혈청을 분리하여 즉시 분석하거나, 샘플을 분주하여 -80°C에 보관합니다. 동결-해동 사이클이 여러 번 반복되지 않도록 합니다.

Plasma(혈장)

EDTA 또는 헤파린을 항응고제로 사용하여 혈장을 수집합니다. 샘플 채취 후 30분 이내에 4°C, 1000 × g에서 15분 간 원심분리합니다. 혈장 분획을 채취하여 즉시 분석하거나, 샘플을 분주하여 -80°C에 보관합니다. 동결-해동 사이클이 여러 번 반복되지 않도록 합니다. 참고: 과다 용혈된 검체(over heamolysed sample)는 이 키트를 사용하기에 적합하지 않습니다.

소변 및 뇌척수액

소변을 멸균 용기에 담아 2000-3000rpm에서 20분간 원심분리합니다. 상등액을 제거하고 즉시 검사합니다. 침전이 감지되면 원심분리 단계를 반복합니다. 뇌척수액에도 유사한 프로토콜이 사용될 수 있습니다.

Cell culture 상등액

Cell culture media(세포 배양 배지)를 피펫으로 취해 4°C, 1500rpm에서 20분간 원심분리합니다. 투명한 상등액을 채취하여 즉시 분석합니다.

세포 용해물(Cell Lysates)

세포들을 lysis buffer에 녹이고 얼음 위에 30분 동안 놓아둡니다. 14,000 x g에서 5분간 원심분리 튜브를 사용하여 불용성 물질을 제거합니다. 상등액을 새 튜브에 넣고 남은 세포 추출물을 버립니다. Total propein assay을 사용하여 총 단백질 농도를 정량화합니다. 즉시 측정하거나, 분주하여 -20°C 이하에 보관합니다.

조직 균질액(Tissue homogenates)

조직 균질액의 준비는 조직 유형에 따라 달라집니다. 1X PBS로 조직을 헹구어 과다 혈액을 제거하고 1X PBS 20ml(protease inhibitor 포함)에 균질화하여 밤새 -20°C이하에서 보관합니다. 세포막을 파괴하기 위해서는 두 번의 동결-해동 사이클이 필요합니다. 세포막을 더 파괴하기 위해 검체를 초음파처리(sonicate)할 수 있습니다. 균질액을 5000xg에서 5분간 원심분리합니다. 상등액을 제거하고 즉시 검사하거나 샘플을 분주하여 -20°C 또는 -80°C에 보관합니다.

조직 용해물(Tissue Lysates)

PBS로 조직을 헹구고 1~2mm 크기로 자른 후 PBS를 넣어 샨녇 homogenizer로 균질화합니다. 용해된 조직과 같은 부피의RIPA buffer(protease inhibitor 포함)를 가하고 상온에서 30분 동안 부드럽게 저어줍니다. 원심분리기를 사용하여 이물질을 제거합니다. Total protein assay을 사용하여 총 단백질 농도를 정량화합니다. 즉시 측정하거나, 분주하여 -20°C이하에서 보관합니다.

모유

모유 샘플을 채취하고 4°C에서 60분 간 10,000 x g에서 원심분리합니다. 상등액을 취하여 분석합니다. 장기간 사용할 경우, 검체를 -80°C에 보관하십시오. 동결/해동 사이클을 최소화합니다.

ELISA Plate Standards

ELISA standards(표준)은, 알려진 농도의 standards(표준 물질)에 근거해 샘플의 흡광도값을 분석하여, 샘플에 있는 analyte(분석물)의 양을 결정할 수 있도록 합니다. 이를 통해 연구자는 분석물 양을 정량적으로 결정할 수 있습니다. ELISA 키트는sample/standard dilution buffer 에 의해 희석될 stock solution of standard(표준 원액)을 제공합니다.

그림 2 : standard dilution buffer를 이용한 stock standard의 순차적7-가지 농도의 표준액 만들기

Standard 희석 가이드라인

참고: 종합적인 검체 희석 가이드라인은 키트와 함께 제공된 데이터시트를 참조하십시오.

제공된 각 standard vial을 1ml(부피는 키트에 따라 다름) sample standard dilution buffer로 희석하여 Standard Stock Solution을 만듭니다. 튜브를 실온에서 10분간 유지하고 완전히 혼합합니다.

Standard series를 생성하기 위해 6개의 microcentrifuge tubes에 라벨링 하고, 각 튜브에 sample/standard dilution buffer 300μl 를 넣습니다. Standard stock 300 μl를 첫번째 튜브에 넣고 골고루 섞습니다. 첫 번째 튜브에서 두 번째 튜브로 300μl를 옮기고 완전히 혼합합니다. Standard series가 완료될 때까지 이 희석 과정을 반복합니다(자세한 내용은 위의 그림 2 참조).

ELISA에 대한 검출 전략

ELISA의 검출 단계는 샘플에 있는 분석물의 양을 측정하는 마지막 단계입니다. 검출 단계에서 생성된 신호는 분석 물질의 양에 비례합니다. ELISA에서 분석 물질을 검출하기 위해, 방사선(Radioactive (Radioimmunoassay)), 형광 태그(fluorescently tagged), 색소생산성 기질(chromogenic substrate) 세가지 방법 중 하나를 사용할 수 있습니다.

Chromogenic은 ELISA 검출을 위해 가장 인기 있고 가장 널리 사용되는 기법이며, horse radish peroxidase (HRP) substrate TMB(3, 3, 5, 5'-tetramethylbenzidine)를 이용합니다. 이는 산화되면 파란색을 나타내고, 황산을 첨가한 후 황색으로 변합니다. ELISA plate reader에서 샘플을 450nm에서 판독할 수 있습니다.

다른 검출 방법으로는 화학발광법(chemiluminescence)이 있습니다. 이는425nm에서 빛을 방출하는 기질인 Luminol을 이용한HRP를 기반으로 합니다.

사전 코팅된 ELISA Kits 와development antibody pair ELISA kits

Assay Genie는 사이토카인, 케모카인, 호르몬, 신호 단백질 및 기타 1000개의 biomarkers 검출을 위해 사전 코팅된 ELISA kit와 ELISA development kit를 제공합니다.

High Sensitivity PharmaGenie ELISA Kits

Assay Genie의 PharmaGenie ELISA kits은 제약 및 생명 공학 연구 분야의 요구를 충족하도록 설계된 고품질 ELISA 키트입니다. PharmaGenie ELISA kit에서 제공하는monoclonal antibody pairs와 시약은 ISO 9001:2000 품질 시스템에 따라 검증되었습니다. PharmaGenie ELISA kits은 미래의 치료제를 발견하기 위한 우수한 분석법입니다.

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  • 천연 항원 및 재조합 항원 특이성 모두 인식
  • 다른 human cytokines과의 교차 반응성 없음을 확인
  • NIBSC에 대한 표준 교정
  • Development ELISA kits (Antibody Pairs)
  • Antibody pairs 연구

Development ELISA kits (antibody pairs)

Development ELISA kits를 통해 연구자들은 자신만의 ELISA plate를 만들 수 있습니다. 이 제품은 antibody pairs (포획 및 검출 항체)와 버퍼가 함께 제공됩니다. 이를 통해 연구자들은 자신만의 ELISA 키트를 코팅하고 플레이트 할 수 있습니다. ELISA Genie는 SuperSet ELISA kit라는 고품질의 다양한 Development ELISA kits을 제공합니다.

  • 고도로 최적화된 monoclonal antibody pair
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SuperSet Development ELISA Protocol

DIY ELISA kits Vs Pre-coated ELISA Kits

특징 Development ELISA Kit Pre-coated ELISA Kit Multiplex ELISA

기질

HRP-TMB

HRP-TMB

PE/APC

배양시간

2-3 시간

2-3 시간

2 시간

감도

pg/ml

pg/ml

pg/ml

Well 당 타겟 수

1

1

24

필요한 기기

ELISA plate reader

ELISA plate reader

Flow Cytometer

ELISA에 이용되는 항체 유형

ELISA kits는 검출 및 포획 항체를 만들기 위해 monocloanl antibody 또는 polyclonal antibody를 사용합니다. Monoclonals은 단일 epitope를 인식하여 특정 항원에 대한 정확한 분석을 제공합니다. 반면 Polyclonals은 많은 양의 항원을 포획하는 이점이 있습니다. 최근에는 recombinant monoclonal antibody가 ELISA 키트를 만드는 데 사용되어 특이성과 일관성을 높이고 있습니다.  

Assay Genie PharmaGenie kit 제품군은IL-1 베타, IFN-감마, IL-2, IL-4, IL-6, CXCL8/IL-8등 주요 cytokine 및 다양한 물질을 대상으로 하는 고품질 monoclonal antibody를 사용하여 제조됩니다.

ELISA Buffers & Recipes

Blocking Buffer는 무엇인가요?

ELISA assay plate에 단백질이 비특이적으로 결합하는 것을 방지하기 위해, blocking buffer를 사용하여 플레이트를 코팅합니다. ELISA 플레이트의binding capacity은 플레이트에 코팅된 단백질 (포획 항체/항원)의 양보다 높습니다. 따라서 후속 배양 단계에서 항체 또는 다른 단백질의 비특이적 결합을 방지하기 위해 나머지 영역을 차단해야 합니다. 이를 위해 blocking buffer에는 후속 단계에서 다른 단백질 또는 검출 항체와 결합되거나 복합체를 형성하지 않는 단백질이 사용됩니다. 따라서 blocking buffer는 비특이적 단백질의 결합을 방지하고 배경 잡음을 감소시켜 신호 대 잡음비(signal to noise ratio)를 증가시키기 때문에 ELISA 감도를 증가시킵니다.

ELISA 개발 중 여러 가지 blocking buffer를 테스트하여 분석을 최적화하고 신호 대 잡음비를 개선해야 합니다. 단백질:단백질 결합의 형성은 단백질의 비특이적 결합에 영향을 줄 수 있는 요인입니다. Blocking buffer를 최적화 할 때 핵심은 신호 대 잡음비의 증가를 최적화하는 것입니다. 이는 분석물질을 가하지 않은 control well을 이용하여 확인합니다.

차단 버퍼를 최적화할 때 과도한 농도의 차단제를 사용하지 않는 것이 중요한데, 이는 과도한 농도의 차단제가 항체-항원 상호 작용을 억제하거나 잠재적으로 효소 활성을 억제하여 신호 대 잡음비를 감소시킬 수 있기 때문입니다. Blocking을 최적화하는 과정에서, 몇 가지 버퍼를 테스트 할 수 있습니다.

Recipe for Blocking Buffer

Phosphate buffered saline (PBS)

1% BSA

Coating Buffer

ELISA 코팅 버퍼는 단백질/분석물 또는 항체를 microtiter plate에 고정시키는 데 사용됩니다. 이때 코팅 버퍼의 pH가 중요 요인이 됩니다. pH 7.4와 pH 9.6 사이의 코팅 버퍼를 선택하면 단백질/항체/분석물 결합의 입체 구조에 영향을 주어 고정화에 영향을 줄 수 있습니다. 코팅 버퍼의 테스트는 고정된 항체의 이동성과 성능을 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다. SuperSet Development ELISA kit에서 plate 하나 당10ml의 코팅 버퍼에 포획 항체 100µl을 추가합니다.

Recipe for Blocking Buffer Ingredient Amounts

Na₂CO₂

1.5g

NaHCO₃

2.93g

Distilled Water

1L (pH 9.6)

TMB

HRP(Horseradish peroxidase) conjugate enzymes의 존재 하에, TMB 과 peroxide은 605 nm에서 최대 흡수율을 갖는 청색 부산물을 생성하기 위해 반응합니다. HRP 활동에 의해 생성되는 색 강도는 ELISA assay의 분석물(analyte) 수준에 비례합니다. TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 배양 후 0.16M sulfuric aicd의 stop solution을 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 첨가되는 stop solution의 양은 ELISA 플레이트의 각 well에 첨가되는 TMB substrate의 양과 같아야 합니다(일반적으로 well 당 50-100uL). Sulfuric acid stop solution을 첨가한 후, 색상이 파란색에서 노란색으로 바뀌어 발색이 안정되면 spectrophotometer(분광광도계)를 이용해 450nm에서 정확한 강도 측정이 가능합니다.

PNPP (p-nitrophenyl phosphate)

pNPP는 alkaline phosphatases를 위한 비색변화를 일으키는 substrate 입니다. pNPP는 alkaline phosphate-conjugated antibody에 사용됩니다. Alkaline phsphatase는 pNPP에서 pNP로의 가수분해를 촉매합니다. 따라서 405nm에서 최대 흡수율을 갖는 노란색 phenolate가 생성됩니다. pNNP는 빛에 민감하므로 빛으로부터 보호해야 합니다.

Wash Buffer

ELISA 세척의 목적은 신호에 영향을 미치는 이물질을 제거하고 ELISA 구성 요소를 보존하는 것입니다. ELISA plate 은 standard및 sample를 첨가하기 전에 세척되며, 검출 항체를 첨가하고 HRP conjugated antibody를 첨가합니다. ELISA 프로토콜에는 Tris 기반 및 PBS 기반 wash buffer가 모두 사용될 수 있습니다.

Recipe for PBS Wash Buffer

Phosphate buffered saline (PBS)

0.05% V/V TWEEN-20
Recipe for Tris-based Wash Buffer (1L)

6.06 g Tris Base

8.2 g NaCl

6.0 ml 6 M HCL

1 L of distilled water

pH should be 7.2 to 7.8, conductivity should be 14,000 to 16,000
Recipe for Wash Solution (1L)

1 L of TBS

5 ml of 10% Tween 20

ELISA plate 세척

ELISA assays는 항체 기반 실험으로, 연구자들이 샘플에 존재하는 분석 물질의 양을 결정할 수 있도록 합니다. ELISA 분석은 면역학, 신경과학, 암 연구에서 염증, growth factor(성장 인자), 신호전달물질에 초점을 맞춘 다양한 대상을 분석하기 위해 일반적으로 사용됩니다. 주요 목표물로는 IL6, IL8, BDNF, VEGF 등이 있습니다.

ELISA 종류 설명

TMB 반응

ELISA 실험의 output을 측정하기 위해, 많은 기질을 사용하여 최종 항체-항원 결합 복합체를 검출할 수 있습니다. Colorimetric, chemiluminescent(화학 발광) 및 fluorescent(형광) 기반 측정이 세 가지 주요 기술입니다. 일반적으로 ELISA는 샘플의 비색변화를 측정하며, TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)는 horse radish peroxidase의 존재 하에서 과산화수소를 물로 환원시키는 데 수소 공여체 역할을 합니다. 이 반응으로diimine이 생성되어 용액의 색이 파란색으로 변합니다. 이 파란색으로의 색변화는 370 nm & 650 nm 분광 광도계에서 읽을 수 있습니다. 이 반응을 멈추기 위해 황산을 샘플에 첨가하여, 노란색으로 변색시킵니다. 그런 다음 분광 광도계를 사용하여 ELISA 플레이트를 분석하여 450 nm에서 판독할 수 있습니다.

ELISA 세척 단계

세척 단계는 ELISA 프로토콜의 핵심 단계입니다. 세척 단계는 background signal(배경 신호)를 줄이기 위해 매우 중요하며, 이는 신호 대 잡음의 비율을 증가시키는 결합되지 않은 conjugated antibody로 인해 발생할 수 있습니다. 따라서 세척 단계는 항원과 항체 사이에 높은 정확도의 결합반응이 일어나도록 보장합니다. 비효율적인 세척이 발생할 경우, background가 높아져 데이터 수집이 방해될 수 있으며, 검체 간의 변동이 심해져 결과적으로 결과가 좋지 않을 수 있습니다.

ELISA 세척 부피 및 변수

ELISA 플레이트에 추가된 wash buffer의 부피는 플레이트를 효과적으로 세척하는 데 중요합니다. ELISA plate washer를 사용하는지 multichannel pipette을 사용하는지에 따라 플레이트를 세척할 때 필요한 부피에 주의해야 합니다. Wash butter 부피는 각 well에 추가된 coating butter의 부피보다 커야 합니다. 예를 들어, 플레이트에 100μL의 coating butter가 코팅된 경우, well을 완전히 세척하려면 더 많은 양의 wash buffer(200~350μL)를 추가해야 합니다.

ELISA plate wash cycles

세척 부피 다음으로, wash cycle의 수는 background 제거를 증가시키면서 antigen-analyte 결합의 불필요한 세척을 방지하기 위해 중요합니다. 검체가 과도하게 세척되면 신호 강도가 저하되고 데이터를 측정 및 분석하기가 어려워질 수 있습니다. 프로토콜 단계에 따라 1-3-5 세척 단계가 필요할 수 있습니다. 일반적으로 사전 코팅된 플레이트는 DIY 코팅된 플레이트보다 세척 단계가 덜 필요하지만, 이는 제조업체와 ELISA 플레이트를 판독하는 데 사용되는 기술에 따라 달라질 수 있습니다.

ELISA plate세척시 버퍼의 흡인 매뉴얼

ELISA 프로토콜 동안 버퍼 흡인은 잔류 버퍼, 원하지 않는 복합체 또는 항체를 제거하는 데 중요합니다. Multichannel pipette을 사용하는 경우 단계마다 새 피펫 팁을 사용합니다. 버퍼를 흡입할 때는 well의 측면 또는 하단에 닿지 않도록 주의하면서 기울어진 각도로 multichannel을 well에 넣습니다. 버퍼를 제거한 후 플레이트를 뒤집고 종이 타월 위에 플레이트를 두드려 잔여 버퍼를 제거할 수 있습니다. 세척 단계와 완충 단계 사이에 플레이트가 마르지 않도록 하십시오.

TMB 반응

ELISA 실험의 output을 측정하기 위해, 많은 기질을 사용하여 최종 항체-항원 결합 복합체를 검출할 수 있습니다. Colorimetric, chemiluminescent(화학 발광) 및 fluorescent(형광) 기반 측정이 세 가지 주요 기술입니다. 일반적으로 ELISA는 샘플의 비색변화를 측정하며, TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)는 horse radish peroxidase의 존재 하에서 과산화수소를 물로 환원시키는 데 수소 공여체 역할을 합니다. 이 반응으로diimine이 생성되어 용액의 색이 파란색으로 변합니다. 이 파란색으로의 색변화는 370 nm & 650 nm 분광 광도계에서 읽을 수 있습니다. 이 반응을 멈추기 위해 황산을 샘플에 첨가하여, 노란색으로 변색시킵니다. 그런 다음 분광 광도계를 사용하여 ELISA 플레이트를 분석하여 450 nm에서 판독할 수 있습니다.

ELISA 데이터 분석

ELISA 프로토콜 완료 후 다음 단계는 ELISA plate reader를 사용하여 데이터를 획득하고 분석하는 것입니다.

ELISA를 수행할 때 결과의 통계적 유의성을 보장하기 위해 샘플을 이중 (duplicate or triplicate)으로 분석하는 것이 좋습니다. 또한, 표준용액 같은 positive control과, blank나 분석하고자 하는 항원이 없는 샘플 같은 negative control이 필요할 수 있습니다.

  • Negative controls : 분석물이 없는 샘플
  • Positive controls : 분석물의 존재 또는 농도가 알려진 샘플

사용된 ELISA의 유형(정성, 반 정량, 정량)에 따라 데이터 출력이 달라집니다. 따라서 분석하고자 하는 데이터에 따라 사용할 특정 ELISA를 선택합니다. 데이터는 시료의 로그 농도 대 광학 밀도(OD : optical density) 의 플롯으로 표시됩니다. 알려진 농도를 가진 표준용액은 분석물의 농도를 결정할 수 있는 표준 곡선을 생성하는 데 사용됩니다.

변동 계수

변동 계수(coefficient of variation)는 결과의 불일치 및 부정확성을 식별하는 데 도움이 됩니다. 이는 평균에 대한 분산의 백분율로 표현됩니다. 분산이 클수록 불일치와 오차가 커집니다. 변동계수(CV : coefficient variation)는 표준 편차 σ와 평균 µ의 비율입니다.

CV= σ/µ

높은 CV는 다음 중 일부 또는 전부에 기인할 수 있습니다:

  • 파이펫팅 부정확성
  • 박테리아/곰팡이 또는 기타 시약으로 인한 시료 오염
  • 온도 변화 : 플레이트는 외기가 닿지 않는 안정적인 온도에서 배양되어야 합니다.
  • Well 의 건조 : 모든 배양 단계에서 플레이트를 덮어 두어야 합니다.

ELISA Plate Readers

ELISA microplate reader는 무엇인가요?

Microplate reader는 다양한 생화학적 변화를 감지하고 분석하기 위해 연구자들이 사용하는 도구입니다. ELISA 플레이트 리더는 한 번에 여러 개의 well을 특정 범위의 파장에서 읽고 분석할 수 있습니다. ELISA 플레이트 리더는 연구자가 효율성을 개선하고 운영 시간과 비용을 절감하는 동시에 다양한 응용 분야에 대한 데이터 분석을 자동화합니다.

ELISA 플레이트 리더는 어떻게 작동합니까?

ELISA 플레이트 리더는 특정 파장의 빛을 감지하여 작동합니다. ELISA 분석의 마지막 단계에서 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)는 HRP에 의해 청색 용액으로 전환되고, 최종적으로 stop solution을 첨가한 후 황색 용액으로 전환됩니다. Well 안의 색상은 샘플에 있는 분석물질의 양에 비례합니다.

플레이트가 ELISA 플레이트 리더에 배치되면, 각 샘플의 흡광도를 450nm에서 판독하여 각 well의 분석물의 양을 결정합니다. 그런 다음 연구자들은 샘플의 측정값과 standard curve의 알려진 값을 플롯하여 각 샘플에 포함된 분석물질의 양을 계산할 수 있습니다.

96 well ELISA plate reader

ELISA 분석 시, 96 well plate에서 검사를 수행하여 각 검체의 분석물질 양을 측정합니다. 플레이트의 형식은 8 point standard curve과 duplicate된 blank로 구성됩니다. 이는 96 well ELISA plate에 있는 20개의 well을 차지합니다. 이것은 연구원이 그들의 96 well ELISA plate에서 38개의 샘플을 duplicate로 측정하기 위한 것입니다.

BMG LABTECH의 SPECTROstar Nano와 Bio-Rad, Thermo, Tecan, Molecular Devices 또는 Biotek의 모든 플레이트 리더를 포함하여 ELISA 검사를 측정할 수 있는 다양한 ELISA 플레이트 리더가 출시되었습니다. 각 플랫폼에는 연구원들이 데이터를 해석할 수 있도록 전용 플레이트 리더 소프트웨어가 함께 제공됩니다.

Company Plate Reader

BMG Labtech

SPECTROSTAR Nano

Biotek

PowerWave HT Microplate Spectrophotometer

BYONOY

ABSORBANCE 96 PLATE READER

Bio-Rad

xMark™ Microplate Absorbance Spectrophotometer

ELISA assay 측정을 위한 Plate Reader 세팅

가지고 있는 ELISA 플레이트 리더에 따라 설정이 달라질 수 있습니다. 그러나 샘플을 측정할 때 다음 설정이 적용될 수 있습니다.

Type Settings

Optic Settings

Absorbance spectrum, Endpoint test
Wavelength 400-700nm

General Setting

Number of flashes: 45
Setting time: 0.2s

Sandwich ELISA는 무엇입니까?

Sandwich ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)는 연구자들이 샘플에서 관심 있는 단백질, 호르몬 또는 분석물의 양을 정량화 할 수 있도록 하는 항체 기반 기술입니다. Capture antibody 및 detection antibody는 단백질의 non-overlapping epitopes에 결합하여 단백질을 사이에 끼우는데, 여기서 샌드위치 ELISA라는 이름이 유래되었습니다. Detection antibody를 첨가한 후 화학 기질(예: TMB)을 첨가하여 ELISA 플레이트 리더가 읽을 수 있는 비색 신호를 생성합니다.

Sandwich ELISA PDF - 다운로드 및 인쇄

Capture Antibody & Detection Antibody

Sandwich ELISA는 샘플에서 특정 단백질의 농도를 측정하는데 사용되는 일반적인 방법입니다. 이 분석은 두 개의 항체가 관심 있는 단백질에 결합하여 단백질 주위에 "샌드위치"를 형성합니다. 첫 번째 항체는 단백질에 결합하고, 두 번째 항체(conjugated with an enzyme)는 첫 번째 항체에 결합합니다. Enzyme substrate이 첨가되면 Sandwich ELISA는 효소 활성의 양을 측정하여 샘플 내 단백질의 농도를 측정할 수 있습니다.

Sandwich ELISA는 샘플의 단백질 농도를 빠르고 쉽게 측정할 수 있는 방법으로 연구와 진단에 귀중한 도구가 됩니다. 또한, 이 분석은 정제하거나 정량화하기 어려운 단백질의 농도를 측정하는 데 사용될 수 있습니다.

Capture antibody(포획 항체)는 샘플에서 단백질 및 다른 생체 분자를 검출하고 정량화하는 데 사용되는 분석법인 sandwich ELISA의 핵심 구성 요소입니다. 포획 항체는 분석물 분자 표면의 특정 표적에 결합하여 검출 항체에 의해 검출되도록 포획합니다.

Detection antibody(검출 항체)는 샘플에서 표적 단백질의 존재 또는 그 양을 나타내는 지표로 작용합니다. 이들은 표적에 결합할 때 빛이나 색 변화와 같은 감지 가능한 신호를 생성할 수 있는 효소와 결합되어 있습니다.

Sandwich ELISA 결합 항체와 검출 항체 : Sandwich ELISA의 도식도. 결합 항체와 검출 항체가 관심 단백질에 결합되어 있다.

항체 결합

Sandwich ELISA는 샘플에서 항원을 검출하는 인기 있는 방법입니다. 이 분석의 원리는 두 개의 항체가 관심 있는 항원을 포착하고 탐지하는 데 사용된다는 것입니다. 첫 번째 항체는 샘플에서 항원을 포착하는 데 사용되며, 두 번째 항체는 포착된 항원을 검출하는 데 사용됩니다. 이 기술은 매우 민감하며 샘플에서 매우 낮은 수준의 항원을 탐지하는 데 사용할 수 있습니다. Sandwich ELISA는 다양한 샘플에서 단백질, 바이러스 및 기타 macromolecules를 검출하는 데 종종 사용됩니다.

Sandwich vs Competitive ELISA

Sandwich ELISA와 competitive ELISA는 샘플에서 특정 분석물의 농도를 측정하는 두 가지 인기 있는 방법입니다. 두 방법 모두 분석물에 결합하기 위해 항체를 사용하지만, 수행 과정에 몇 가지 중요한 차이점이 있습니다.

ELISA 종류 설명

Sandwich ELISA

Sandwich ELISA는 두 개의 다른 항체를 사용하는데, 그 중 하나는 고체 표면에 부착되어 있습니다. 그 후 분석물이 혼합물에 첨가되고, 표면에 결합된 항체에 결합할 하게 됩니다. 검출 가능한 마커에 결합된 두 번째 항체가 추가됩니다. 이 두 번째 항체는 분석 물질에 결합하고, 마커로부터의 신호는 샘플에서 분석 물질의 농도를 결정하는 데 사용됩니다.

Competitive ELISA

반면 competitive ELISA는 검출 가능한 마커와 결합된 단일 항체를 사용합니다. 분석물 및 알려진 양의 "competing(경쟁)" 분석물이 혼합물에 첨가됩니다. 경쟁 분석물은 항체와의 결합을 위해 샘플 분석물과 경쟁합니다. 그런 다음 마커의 신호를 사용하여 샘플 안의 분석물 양을 결정합니다.

그렇다면, 이 두 가지 방법의 주요한 차이점은 무엇일까요? Sandwich ELISA는 competitive ELISA보다 민감도가 높아 낮은 농도의 분석물을 검출할 수 있습니다. Sandwich ELISA는 또한 샘플 내의 다른 물질의 간섭을 덜 받기 때문에 보다 특이적인 방법입니다. Competitive ELISA는 sandwich ELISA보다 빠르고 쉽게 실행할 수 있어, 경우에 따라 더욱 편리한 옵션이 됩니다.

Sandwich ELISA 항체

Sandwich ELISA를 만드는 데 사용되는 항체는 검출되는 특이성, 민감도 및 분석 물질에 따라 polyclonal antibody 또는 monoclonal antibody일 수 있습니다.

> Polyclonal antibody

Polyclonal antibody는 종종 샘플에서 가능한 많은 분석물을 끌어내는데 사용됩니다. 따라서 polyclonal antibody는 epitope의 여러 면에 결합할 수 있으며, 이는 관심 있는 단백질을 검출하기 위한 포획 기회를 증가시킵니다.

> Monoclonal antibody

Monoclonal antibody는 연구자들이 단일 항원을 검출할 수 있게 합니다. 그러므로, 단백질 사이의 미묘한 차이를 구별할 수 있도록 해줍니다. 또한 monoclonal antibody는 polyclonal antibody 대비 데이터의 일관성을 증가시킵니다.

Sandwich ELISA의 장점

장점 설명

샘플 정제 불필요

Sandwich ELISA assay는 정제과정 없이, 복합적인 샘플의 단백질/분석물 측정을 가능하게 합니다.  

높은 특이성

결합 및 검출 항체가 이용되므로, sandwich ELISA assay는 indirect ELISA assay에 비해 높은 민감도를 나타냅니다.

정량화

Western Blot 과 같은 다른 EIA 방법과 비교했을 때, sandwich ELISA assay는 연구자들이 샘플 내 단백질의 양을 정량화 할 수 있게 해줍니다.

Sandwich ELISA 프로토콜

Sandwich ELISA assay는 연구자들이 혈청, 혈장, 세포 상등액, 조직 및 기타 생물학적 샘플에서 관심 있는 단백질을 정량화하는 데 도움을 줍니다. Sandwich ELISA kit는 두 가지 형식으로 구입할 수 있습니다. 포획 항체가 polystyrene ELISA plate에 이미 코팅되어 있는 Pre-coated ELISA plate를 구입하거나, antibody pairs을 구입하여 자체 ELISA Sandwich assay을 개발할 수 있습니다. 아래에서는 두가지 프로토콜에 대해 설명합니다.

Sample 준비 및 채취

다양한 종류의 샘플을 사용하여 Sandwich ELISA를 통해 단백질/분석물 수치를 측정할 수 있습니다.

모범실험방법에 따라, 샘플 채취 후 가능한 한 빨리 단백질 추출 및 실험 수행을 진행하십시오. 또는 추출물을 지정된 온도(-20°C/-80°C)에서 보관하고, 최적의 결과를 위해 동결-해동 사이클이 반복되지 않도록 합니다.

혈청(Serum): serum separator tube를 사용하는 경우, 샘플을 실온에서 30분 동안 응고시킵니다. 1,000xg에서 10분간 원심분리기합니다. 혈청 분획을 채취하여 즉시 분석하거나, 샘플을 분주하여 -80°C에 보관합니다. 동결-해동 사이클이 여러 번 반복되지 않도록 합니다.

Serum separator tube를 사용하지 않는 경우 샘플이 밤새 2-8°C에서 응고되도록 두십시오. 1,000xg에서 10분간 원심분리합니다. 혈청을 즉시 분석하거나, 샘플을 분주하여 -80°C에 보관합니다. 동결-해동 사이클이 여러 번 반복되지 않도록 합니다.

혈장(Plasma): EDTA 또는 헤파린을 항응고제로 사용하여 혈장을 채취합니다. 샘플 채취 후 30분 이내에 4°C에서 1000 × g에서 15분 동안 원심분리합니다. 혈장 분획을 채취하여 즉시 분석하거나, 분주하여 샘플을 -80°C에 보관합니다. 동결-해동 사이클이 여러 번 반복되지 않도록 합니다. 참고: 과다 용혈된 검체는 사용하기에 적합하지 않습니다.

다양한 샘플 유형에 대한 자세한 내용은 샘플 수집 가이드를 참조하십시오.

Sandwich ELISA 방법: pre-coated ELISA plate용 sandwich ELISA 프로토콜. sandwich ELISA assay와 관련된 단계별 도식도입니다. 먼저 standard를 준비하고, 이어서 ELISA plate에 샘플을 첨가하여 배양합니다. 플레이트를 세척한 후, 라벨이 부착된 항체를 첨가하고 배양합니다. 플레이트를 세척하고 SABC working solution을 가합니다. 플레이트를 세척하고 TMB substrate을 넣은 다음 배양합니다. 마지막으로 stop solution을 가하고 측정합니다.

Pre-coated Sandwich ELISA 프로토콜

단계 과정

1.

사전 코팅된 플레이트에 standard, sample 및 control(zero) well을 각각 설정하고 위치를 기록합니다. 각 standard과 sample을 중복(duplicate)하여 측정하는 것이 좋습니다. Standard, sample 및 control(zero) well을 추가하기 전에 플레이트를 2회 세척합니다.

2.

Standard solution 0.1ml를 stand well에 주입합니다.

3.

Sample/standard dilution buffer 0.1ml를 control(zero) well에 주입합니다.

4.

적절하게 희석된 샘플(인간 혈청, 혈장, 조직 균질체 및 기타 생물학적 액체) 0.1ml를 sample well에 주입합니다.

5.

덮개로 플레이트를 덮어 37°C에서 90분 동안 배양합니다.

6.

커버를 제거하고 플레이트 내용물을 폐기하고 플레이트를 흡수성 필터 용지 또는 기타 흡수성 물질에 끼웁니다. 항상 well이 완전히 마르지 않도록 주의합니다. 플레이트를 2회 세척합니다.

7.

앞서 설명한 well(standard, test sample 및 zero wells)에 biotin-detection antibody workingsolution 0.1ml를 넣습니다. 측벽을 건드리지 않고 각 well의 바닥에 용액을 가합니다.

8.

덮개로 플레이트를 덮어 37°C에서 60분 동안 배양합니다.

9.

커버를 제거하고, 플레이트를 wash buffer로 3회 세척합니다. 각 세척 과정 사이에 1분 동안 wash buffer를 well에 넣어둡니다.

10.

0.1ml SABC working solution을 각 well에 넣습니다. 플레이트를 덮어 37°C에서 30분 동안 배양합니다.

11.

커버를 제거하고, 플레이트를 wash buffer로 5회 세척합니다. 각 세척 과정 사이에 1-2분 동안 wash buffer를 well에 넣어둡니다.

12.

각 well에 TMB substrate 90μl를 넣고 플레이트를 덮은 후 어두운 곳에서 15~30분 이내에 37°C에서 배양합니다 (참고: 이 배양 시간은 참조용으로만 사용되며, 최적 시간은 최종 사용자가 결정해야 합니다.) 그리고 파란색의 색조는 첫 번째 3-4개의 well(대부분의 농축된 standard solution에서)에서 볼 수 있지만, 다른 well은 뚜렷한 색을 보이지 않습니다.

13.

각 웰에 Stop solution 50 μl를 넣고 완전히 혼합합니다. 색깔이 즉시 노란색으로 바뀝니다.

14.

Stop solution을 가한후, 즉시 microplate reader를 이용해 450nm에서 흡광도를 측정합니다.

그림 3: pre-coated ELISA plate용 sandwich ELISA 프로토콜. pre-coated ELISA plate용 sandwich ELISA 프로토콜. sandwich ELISA assay와 관련된 단계별 도식도입니다. 먼저 standard를 준비하고, 이어서 ELISA plate에 샘플을 첨가하여 배양합니다. 플레이트를 세척한 후, 라벨이 부착된 항체를 첨가하고 배양합니다. 플레이트를 세척하고 SABC working solution을 가합니다. 플레이트를 세척하고 TMB substrate을 넣은 다음 배양합니다. 마지막으로 stop solution을 가하고 측정합니다.

DIY ELISA Sandwich Protocol

그림4. Development ELISA kit를 위한sandwich ELISA 프로토콜. Sandwich ELISA assay를 위한 단계별 과정의 도식도.

Capture antibody를 이용한 coating plate

단계 과정

1.

희석된 capture antibody 100 µl를 각well에 가한다.

2.

플라스틱 플레이트 커버를 덮고 4℃에서 밤새 배양한다.

3.

커버를 제거하고 다음과 같이 플레이트를 세척한다.

a) 각 well의 액체를 흡인한다.

b) 각 well에3ml washing solution을 가한다.

c) 각 well의 내용물을 흡인한다.

d) 과정 b와 c를 반복한다.

4.

모든 well에 blocking buffer 100 µl를 가한다.

5.

플라스틱 플레이트 커버를 덮고 실온(18-25℃)에서 2시간 배양한다.

6.

커버를 제거하고 다음과 같이 플레이트를 세척한다

a) 각 well의 액체를 흡인한다.

b) 각 well에3ml washing solution을 가한다.

c) 각 well의 내용물을 흡인한다.

d) 과정 b와 c를 반복한다.

7.

플레이트를 바로 이용하기 위해서 다음 단계를 계속한다.

만약 coated and blocked plate를 나중에 사용하고 싶다면, 각 플레이트를 상온(18~25°C)에서 24시간 동안 벤치 드라이한다. 그런 다음 건조제와 함께 밀봉된 비닐 봉지에 넣어2-8°C에서 최대 12개월까지 보관한다.

Sandwich ELISA protocol 개발

단계 과정

1.

Standard curve를 준비한다.

2.

적절한 well에 이중으로(duplicate) standard, sample 또는 zero(standard dilution buffer) 100µl를 가한다.

3.

희석된 detection antibody 50µl를 모든 well에 가한다.

4.

플라스틱 플레이트 커버를 덮고 실온(18-25℃)에서 2시간 배양한다.

5.

커버를 제거하고 다음과 같이 플레이트를 세척한다

a) 각 well의 액체를 흡인한다.

b) 각 well에3ml washing solution을 가한다.

c) 각 well의 내용물을 흡인한다.

d) 과정 b와 c를 반복한다.

6.

Streptavidin-HRP solution 100µl를 모든 well 에 가한다.

7.

플라스틱 플레이트 커버를 덮고 실온(18-25℃)에서 30분 배양한다.

8.

5번 세척단계를 반복한다.

9.

Ready-to-use TMB substrate solution을 100µl를 모든 well 에 가한다.

10.

실온에서 5-15분* 동안 어두운 곳에서 배양한다. 플레이트를 알루미늄 호일로 싸서 빛에 직접 노출되지 않도록 한다.

11.

Stop reagent 100µl를 모든 well에 가한다.

12.

단계11 직후, spectrophotometer를 사용해 450nm를 primary wave length로, 선택적으로 630nm(610nm에서 650nm가 적합)를 reference wave length로 하여 각 well의 흡광도를 측정한다.

Competitive ELISA는 무엇인가요?

Competitive ELISA 분석은 샘플 내 분석물의 양을 측정하거나 다른 조건들에서 분석물 양의 변화를 측정하는데 이용됩니다. Competitive ELISA 분석은 샘플 내 다양한 대사체, 호르몬 및 단백질을 효과적/정량적/경제적으로 측정할 수 있습니다. Sandwich ELISA와 유사하게, competitive ELISA는 일차 항체 및 효소와 연결된 이차항체를 이용하여 샘플내 분석물의 양을 측정합니다. Text

그림 3: Competitive ELISA의 원리. ELISA plate에 고정된 분석물에 일차항체가 결합한다. 효소와 결합된 검출 이차항체(enzyme-lined detection secondary antibody)가 capture antibody와 결합한다.

Competitive ELISA 분석의 장점 및 단점

Competitive ELISA 분석은 코르티솔(Cortisol), T3, 하이드록시프롤린(hydroxyproline), 세로토닌(serotonin)과 같은 다양한 호르몬 및 신호물질을 분석하는데 훌륭한 도구입니다. Competitive ELISA는 고가의 장비를 사용하지 않고도, 분석물을 측정할 수 있는 저렴하고 효과적이며 빠른 연구방법을 제공합니다.

장점 단점

복합적 샘플 내의 분석물 측정: competitive ELISA분석의 장점은 복합적인 생물학적 샘플 내에 있는 관심 분석물을 분석할 수 있는 능력에 있습니다. 분석과정에서 capture antibody와 샘플을 혼합하는데, 이는 결합항체-분석물 복합체(capture-analyte complex)를 효과적으로 생성하도록 해줍니다.

Negative controls에서 양성 결과가 도출될 수 있습니다: well이 제대로 차단되지 않았을 경우, 항원이나 이차항체가 well에 비특이적 결합을 할 수 있습니다.

신호가 샘플 내 항원의 양과 반비례합니다: 항원이 고농도로 포함된 샘플의 경우, 약한 신호가 생성되고 분석 범위에 영향을 줄 수 있습니다. 적절한 농도 범위에서 측정하기 위해 샘플의 희석 과정이 필요할 수 있습니다.

Competitive ELISA 표준곡선

Competitive ELISA 분석은 capture antibody가 샘플 내의 항원과 경쟁하는 원리를 기반으로 합니다. 첫째로, 표지 되지 않은 결합항체(unlabeled capture antibody)가 분석하고자 하는 항원을 포함한 샘플과 함께 배양됩니다. 이때 항체-항원 복합체가 형성됩니다. 이 과정에서 과잉의 항체가 가해지고, 결과적으로 배양 과정 후에 결합하지 않은 항체(free antibody)가 남게 됩니다.

다음 단계에서, 분석하고자 하는 항원(inhibitor antigen)이 미리 코팅된 ELISA plate에 항체-항원 복합체를 가합니다. 첫번째 단계에서결합하지 않고 남은 항체가 plate에 있는 inhibitor antigen에 결합하게 됩니다. 미리 생성된 항체-항원 복합체는 다음 세척단계에서 제거됩니다.

다음으로, 효소와 결합된 검출항체(enzyme-linked detection antibody)를 plate에 가합니다. 이는 inhibitor antigen에 결합된 일차항체에 결합하게 됩니다. 마지막으로, substrate를 가하면 비색변화가 일어납니다. 신호의 세기는 샘플 내의 항원의 양과 반비례하여 나타납니다.

그림 4: Competitive ELISA 표준곡선. 샘플 내 분석물의 양은 흡광도에 반비례하는데, 이는 복합체 형성 단계에서 포획항체와 항원이 결합하기 때문이다. Text

아래의 프로토콜은 Competitive ELISA kit을 위한 예시입니다. Competitive ELISA kits은 샘플 내 분석물의 검출 및 정량화를 가능하게 합니다. 이를 통해 연구자들은 샘플 안의 분석물의 양을 계산할 수 있습니다. 이는 단백질 농도 증가, 단백질의 인산화(phosphorylation) 또는 단백질 농도의 감소를 측정하는데 매우 유용합니다.

Competitive ELISA protocol step-by-step

그림 5: Competitive ELISA 프로토콜.

단계 과정

1.

Standard, 실험할 sample 및 control을 pre-coated plate의 well에 넣고, 각 위치를 기록한다. 각 standard과 sample은 이중으로 측정(duplicate)하는 것이 권장된다. Standard, sample 및 control을 가하기 전에 plate를 2회 세척한다.Text

2.

sample과 biotin-detection antibody를 가한다: standard, blank (sample/standard dilution buffer) 또는 sample을50µl 가한다. Blank well에는 sample/standard dilution buffer을 가한다. 즉시 biotin-detection antibody working solution을 각 well에 가한다. 제공된 Plate sealer로 플레이트를 덮은 후, 조심스럽게 톡톡 두드려 잘 섞이도록 한다. 37°C에서 45분간 배양한다. (용액을 가할 때는 plate 벽에 닿거나 거품이 생기지 않도록, micro ELISA plate well의 바닥에 가한다)

3.

세척: 각 well을 흡인하고 세척한다. 설명서에 따라 이 과정을 3회 반복한다.

4.

HRP-Streptavidin Conjugate (SABC): 100µl의 SABC working solution을 각 well에 넣어준다. 새로운 plate sealer로 덮는다. 37°C에서 30분간 배양한다.

5.

세척: 설명서에 따라 흡인/세척 과정을 5회 반복한다.

6.

TMB Substrate: 90µl의 TMB Substrate를 각 well에 가한다. 새로운 plate sealer로 덮는다. 37°C에서 15-20분간 배양한다. 빛이 닿지 않도록 한다. 반응시간은 실제 색깔 변화에 따라 늘리거나 줄일 수 있는데, 30분을 넘지 않도록 한다. Standard well에 농도에 따른 점진적인 색 변화가 보이면 반응을 끝낼 수 있다.

7.

중지: 각 well에50µl의 중지액(stop solution)을 넣는다. Well이 즉시 노란색으로 변한다. Stop solution을 가하는 순서는 substrate solution을 넣은 순서와 반드시 같아야 한다.

8.

OD 측정: 450nm로 설정된 microplate reader를 이용하여, 각 well의 광학 밀도(OD Value)를 동시에 측정한다. 측정 전에 반드시 microplate reader를 열고, 기구를 예열시키고, 실험 변수를 설정해야 한다.

Direct ELISA 프로토콜

Direct ELISA테크닉은 enzyme-labelled antibody가 용액안에 있는 분석물과 결합하는데 이용되는 실험법입니다. 일단 결합하면, enzyme-labelled antibody는 substrate와 반응하여 비색변화를 일으키고, 분석물의 정량화를 가능하게 합니다.

단계 과정

1.

Microtiter plate를 antigen/analyte로 코팅한다.

2.

플레이트를 덮어 4℃에서 밤새 배양한다.

3.

플레이트를 wash buffer 300µl로 3회 세척한다.

4.

Blocking buffer를 가하고37℃에서 1시간 배양한다.

5.

wash buffer 300µl로 4회 세척한다.

6.

적절한 농도의 sample과 standard를 정해진 well에 가한다.

7.

37℃에서 90분간 배양한 뒤, 4℃에 밤새 둔다.

8.

wash buffer 300µl로 3회 세척한다.

9.

Biotin-conjugated streptavidin을 wash buffer에 가한다.

10.

37℃에서 1시간 배양한다.

11.

wash buffer로 3회 세척한다.

12.

정해진 well에 Substrate solution을 가한다.

13.

원하는 비색변화가 관찰될때까지 실온에서 배양한다.

14.

Stop solution을 가한다.

15.

흡광도를 측정한다.

Indirect ELISA 프로토콜

Indirect ELISA는 Western Blot과 유사하지만, 이차항체가 일차항체에 결합합니다.

단계 과정

1.

Microtiter plate를 antigen/analyte로 코팅한다.

2.

플레이트를 덮어 4℃에서 밤새 배양한다.

3.

Wash buffer 300µl로 3회 세척한다.

4.

Blocking buffer를 가하고37℃에서 1시간 배양한다.

5.

wash buffer 300µl로 4회 세척한다.

6.

적절한 농도의 sample과 standard를 정해진 well에 가한다.

7.

37℃에서 90분간 배양한 뒤, 4℃에 밤새 둔다.

8.

wash buffer 300µl로 3회 세척한다.

9.

정해진 well에 wash buffer에 들어있는 detection antibody를 가한다.

10.

37℃에서 1시간 배양한다.

11.

wash buffer로 3회 세척한다.

12.

정해진 well에 Substrate solution을 가한다.

13.

원하는 비색변화가 관찰될때까지 실온에서 배양한다.

14.

Stop solution을 가한다.

15.

흡광도를 측정한다.

검출 및 데이터 분석

Horse Radish Peroxidase(HRP)와 Alkaline phosphatase 는 Sandwich ELISA 방법의 분석물 검출을 위해 가장 널리 이용되는 효소로, 연구자들에게 연구에 맞는 다양한 옵션을 제공합니다.

P-Nitrophenyl-phosphate (pNPP)

pNPP는 ANP substrate 입니다. pNPP를 가하고, 샘플을 상온에서 10-30분간 배양합니다. 0.75M NaOH를 가해 반응을 중단시키고 405nm에서 샘플을 측정합니다.

Hydrogen Peroxide

Hydrogen peroxide(과산화수소)는 HRP의 substrate 로, 반응중에 비색변화를 나타나게 합니다.

TMB (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)

TMB는 HRP의 존재하에서 과산화수소의 환원에 따라 색 변화를 나타냅니다. 이 반응을 억제하기 위해 황산을 첨가하고, 반응은 ELISA plate reader로 450 nm에서 측정할 수 있는 색 변화를 나타냅니다.

결과 계산

다음 방정식을 사용하여 계산합니다.

Relative(상대적) O.D.450 = (각 well의 O.D.450) – (zero well의 O.D.450)

표준 곡선은 각 standard solution(Y)의 relative O.D.450 대 standard solution의 각 농도값(X)으로 플롯할 수 있습니다. Sample의 농도는 standard curve(표준 곡선)에서 구할 수 있습니다. Curve expert 1.3과 같은 전문 소프트웨어를 사용하는 것이 추천됩니다.

참고: 측정된 샘플이 희석된 경우, 희석 전 농도를 계산하기 위해서 표준곡선으로부터 계산된 농도에 희석계수를 곱해줍니다.

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