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Cell Culture Guide - Techniques and Protocols - Mandarin

细胞培养指南——技术与方案 | Assay Genie
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细胞培养指南——技术与方案

哺乳动物细胞组织培养技术指南，涵盖细胞维持、传代/分裂与冻存等内容。请注意：所有细胞培养必须使用无菌技术在层流罩中进行。

适用：哺乳动物贴壁与悬浮细胞系　·　作者：Assay Genie 技术团队
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1引言

细胞培养是细胞和分子生物学中使用的关键工具，可对细胞的生理学和生物化学进行建模。此外，细胞培养使研究人员能够确定药物和有毒化合物对细胞反应的影响。由于使用一批克隆细胞可获得一致和可重复的结果，细胞培养仍是当今研究中使用最广泛的技术之一。

来自动物或植物的细胞在有利环境中的生长被称为细胞培养。不同的细胞有不同的培养要求，可通过培养基的选择与补充剂来满足以达到最佳生长效果。培养基的作用是提供必需营养物质（氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质）、生长因子、激素与气体（O₂、CO₂），并调节物理化学环境（pH 值、渗透压、温度）。

1.2 原代培养 vs 细胞系

原代培养是指在组织分离后直接进行培养的细胞。一旦这些细胞汇合、占据烧瓶中所有可用空间，就需要转移到新的生长容器中进行传代或分割，为细胞提供更多继续生长与扩展的空间。第一次传代后，原代培养即成为所谓的细胞系。源自原代培养的细胞系寿命有限，在衰老之前只能分裂有限的次数。

由于细胞被传代，生长能力最强的细胞占优势，导致群体的基因型与表型趋于一致。永生细胞系广泛用于细胞和分子生物学，以绕过衰老等问题。细胞可通过自发、化学或病毒等多种方式转化并永生。一旦转化，这些细胞就获得无限分裂的能力，成为一个连续的细胞系。

1.3 贴壁细胞和悬浮细胞

细胞系可以是：

  • 贴壁（贴壁依赖性）——必须在附着于固体或半固体底物上时进行培养，通常需要胰蛋白酶法进行亚培养（详见 2.6）。
  • 悬浮（与锚固无关）——不需要固体生长底物，可悬浮在培养基中生长。

2细胞培养指南

以下是细胞系培养的通用指南。所有细胞培养必须在微生物安全柜中进行，使用无菌技术确保无菌。研究人员必须全程穿着防护服。

2.1 无菌技术和层流罩的制备

良好的无菌技术旨在创建无菌环境，并充当微生物与无菌细胞培养罩之间的屏障。关键包括使用无菌试剂与培养基，并确保未经 70% 乙醇喷洒的物体不进入罩内。

层流罩制备：细胞培养罩可提供无菌工作区，同时控制微生物操作产生的传染性飞溅物或气溶胶。培养罩分为 I 级、II 级和 III 级三种，以满足不同的研究与生物安全需求，请根据实验需求选择合适的产品。

使用层流罩
  1. 取下盖子并打开层流罩。
  2. 将层流罩窗扇关闭至适当位置，以保持层流空气。
  3. 用 70% 乙醇喷洒层流罩的所有表面区域。
  4. 避免杂乱堆放。
  5. 确保所有使用的设备（移液器吸头、移液器、机架、Eppendorf 管、烧瓶、试剂）均为无菌，再放入罩内；可通过高压灭菌或使用预灭菌、不含 DNase/RNase 的耗材实现，并用 70% 乙醇喷洒移液器与机架。
  6. 所有培养基、补充剂与试剂必须无菌，以防止微生物在细胞培养物中生长；未提供无菌的试剂需过滤除菌。
  7. 避免直接从瓶或烧瓶中倒入培养基和试剂。
  8. 每个移液器只使用一次，以避免交叉污染。
  9. 在准备使用并置于罩内之前，不要拆开无菌移液器的包装。
  10. 只有在准备使用时才揭开无菌烧瓶、瓶子、培养皿等的盖子，切勿暴露在环境中，使用完毕立即盖回。
  11. 若必须将取下的盖子放在工作面上，请将开口朝上放置。

2.2 细胞生长培养基的制备

开始前，确保针对目标细胞系使用正确的培养基类型与补充剂。培养基必须始终无菌，并只能在罩内打开。大多数细胞系可使用 DMEM，或含 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 培养基；如有需要，可加入 2 mM 谷氨酰胺和抗生素。

如何准备 DMEM 培养基
  1. 从 500 mL 的瓶子中取出 50 mL 培养基。
  2. 此时体积为 450 mL。
  3. 加入 10% FBS = 50 mL。
  4. 加入补充剂：2 mM 谷氨酰胺 = 5 mL，100 U 青霉素 / 0.1 mg/mL 链霉素 = 5 mL。

2.3 创造正确的培养环境

某些内皮细胞系需要特殊的胶原蛋白基质才能生长，这些基质可确保细胞的附着、分化与生长。开始实验前，应对目标细胞系进行文献调查，以确保满足任何额外的生长要求（如基质）。注意所用烧瓶类型（通气或不通气）：非通气/塞瓶烧瓶请松开盖子以进行气体交换；通气烧瓶请确保过滤器不被润湿，以免影响气体交换效率。

如何为内皮和上皮细胞制备 1% 明胶基质
  1. 用蒸馏水稀释后过滤，制备 10 mL 由 1% 明胶 / 1% 纤连蛋白组成的包被溶液。
  2. 该体积可覆盖约 5 个烧瓶。
  3. 将包被溶液吸取到烧瓶中。
  4. 来回摇动，使基质均匀分布在烧瓶表面。
  5. 放入培养箱中静置 15–30 分钟。
  6. 接种前用吸气方式彻底清除包被溶液。

2.4 检查细胞

每天应在显微镜下检查细胞，确保其健康并按预期生长。熟悉健康细胞在显微镜下的外观非常重要，这将更容易通过形态变化发现静止或被感染的细胞。

如果出现以下情况，请丢弃细胞：
  • 培养基由粉红/红色变为暗黄色——这是感染或代谢异常的迹象。
  • 贴壁细胞大量脱落——表明细胞死亡。
  • 细胞外观发生显著变化——看起来散乱并呈颗粒状。
  • 细胞进入静止状态。

2.5 分裂细胞

哺乳动物细胞汇合时应分裂/传代，通常在烧瓶 70–80% 面积被细胞覆盖时进行。贴壁细胞在显微镜下无可见生长空间即为汇合；悬浮细胞则表现为细胞凝聚成团、旋转烧瓶时培养基显得混浊。

切勿让细胞过度汇合，70–80% 汇合为最佳；过度汇合会启动接触抑制，细胞重新接种后需要更长的恢复时间。细胞系的生长速度决定所用的分裂比——生长缓慢的细胞系若以过高比例分裂将表现不佳。通常分裂比不应超过 1:10，否则接种密度过低，细胞难以存活。改变接种密度可确保细胞在特定日期准备好用于实验。

通用参考：由 70–80% 汇合烧瓶分裂，1:2 约 1–2 天可用于实验；1:5 约 2–4 天；1:10 约 4–6 天可再次亚培养或铺板。具体取决于细胞系的生长速率。

2.6 分裂细胞方案

准备工作
  1. 确保细胞至少汇合 80%。
  2. 将新鲜培养基在 37℃ 水浴或培养箱中预热至少 30 分钟。
  3. 确保烧瓶正确标注代号、细胞系、分裂比例与日期。
  4. 准备一个盛有漂白剂的废液容器，可容纳约 100 mL 的 10% 次氯酸钠废液。

2.6.1 对于松散粘附的细胞（细胞刮除）

  1. 小心地将培养基倒入废液容器。
  2. 在烧瓶中加入等体积的预热新鲜培养基。
  3. 使用细胞刮刀将细胞从烧瓶底部轻轻刮入培养基中。
  4. 确保已从烧瓶上刮下所有细胞。
  5. 用血清移液器取出所需量的细胞悬液：1:2 分裂取 50 mL/100 mL；1:5 取 20 mL/100 mL；1:10 取 10 mL/100 mL，加入新烧瓶。
  6. 将所需体积加入预热新鲜培养基：25 cm² 烧瓶约 5–10 mL，75 cm² 约 10–30 mL，175 cm² 约 40–150 mL。

2.6.2 对于贴壁细胞（胰蛋白酶）

  1. 小心地将培养基从烧瓶倒入废液容器。
  2. 使用无菌技术，将预热的 PBS 移入烧瓶，洗去残留培养基与 FBS。
  3. 轻轻前后摇动烧瓶冲洗细胞后倒入废液容器，重复 3 次；去除残留 FBS 对有效胰蛋白酶消化很重要。
  4. 洗涤完成后加入预热的胰蛋白酶-EDTA，用量以覆盖细胞为准：25 cm² 约 1 mL，75 cm² 约 5 mL，175 cm² 约 10 mL。
  5. 如同 PBS 操作轻轻摇动烧瓶，使胰蛋白酶与所有细胞接触。
  6. 将烧瓶放入 37℃ 培养箱；不同细胞系消化时间不同，需每隔几分钟在显微镜下检查并轻敲烧瓶助细胞脱落，避免过度消化。
  7. 细胞脱落后向烧瓶加入培养基，培养基中的 FBS 会使胰蛋白酶失活。
  8. 沿烧瓶壁轻轻上下吹打，去除其余粘附细胞。
  9. 计数细胞，将所需体积移入新烧瓶并补足培养基：25 cm² 约 5–10 mL，75 cm² 约 10–30 mL，175 cm² 约 40–150 mL。
  10. 过夜放置细胞，使其恢复并稳定。
胰蛋白酶消化可能对某些细胞有毒，也可能诱导某些膜蛋白暂时内化，设计实验时应予以考虑。此类情况下可改用温和的细胞刮擦或清洁剂等方法。

2.6.3 对于悬浮细胞

  1. 部分悬浮细胞系有建议的分裂比例或传代密度，开始前请先查阅。
  2. 用移液器从烧瓶取出所需量的细胞悬液加入新烧瓶：1:2 取 50 mL/100 mL；1:5 取 20 mL/100 mL。
  3. 向新烧瓶加入所需量的预热培养基：1:2 分裂取 50 mL 悬液并加 50 mL 新鲜培养基；1:5 取 20 mL 悬液并加 80 mL 新鲜培养基。

2.7 更换介质

如果细胞已生长数天但汇合程度不足以分裂，则必须更换培养基以补充营养并维持 pH 值。

对于贴壁细胞
  1. 使用前将培养基在水浴或培养箱中预热至少 30 分钟。
  2. 将旧培养基倒入废液容器。
  3. 用相同体积的预热新鲜培养基更换，放回培养箱。
对于悬浮细胞
  1. 使用前将培养基预热至少 30 分钟。
  2. 将含细胞的培养基倒入 15 mL 或 50 mL 离心管并离心，转速与时间因细胞系而异。
  3. 离心后细胞沉于管底，弃去旧培养基，将沉淀重悬于等体积新鲜培养基中。
  4. 移入新鲜烧瓶并放回培养箱。

2.8 传代数

传代数是细胞经历亚培养的次数，应记录且不宜过高。与低传代细胞相比，传代数大于 30 的细胞系更可能出现遗传异常（Esquenet et al., 1997; Lin et al., 2003; O’Driscoll et al., 2006）。

P30 通常被视为某些细胞的传代上限，进一步培养可能导致分子谱显著变化，限制其体内应用与可重复性（Calles et al., 2006; O’Driscoll et al., 2006; Wenger et al., 2004）。

2.9 冷冻细胞

冷冻细胞系是细胞培养的重要组成部分：更换细胞系既昂贵又费时，冻存还可在细胞被感染时提供备用库存以重新开始。一旦有多余细胞（最好为低传代以限制遗传漂变），应将其冻存为接种库存，再由其准备使用的细胞。

冻存细胞最佳且最常用的方法是保存在含冷冻保护剂（如二甲基亚砜 DMSO）的液氮中。DMSO 可降低培养基凝固点并降低冷却速度，大大降低导致细胞死亡与损伤的冰晶形成风险。

冷冻细胞方案
  1. 通过细胞计数与所需冷冻培养基体积确定活细胞总数。
  2. 离心细胞悬液，转速与时间因细胞类型而异。
  3. 在不扰动沉淀的情况下弃去上清。
  4. 按特定细胞类型建议的活细胞密度，将沉淀重悬于冷的冷冻培养基中。
  5. 将悬液分装到冻存管中，清楚标注日期、细胞类型与传代号。
  6. 在程序降温设备中以每分钟约 1℃ 降温冷冻；或将冻存管置于异丙醇冷冻盒中于 –80℃ 过夜。
  7. 将冻存细胞转移至液氮，并在液氮上方气相中储存。
以尽可能高的浓度与尽可能低的传代数冻存细胞。冻存前确保至少 90% 的细胞存活；始终使用无菌冻存管，并在层流罩中采用适当无菌技术操作。
安全注意事项：
  • DMSO 会促进有机分子进入组织，使用时应格外小心；处理时请戴手套并穿着适当防护服，并按当地法规处置试剂。

2.10 解冻冷冻细胞

解冻对冷冻细胞压力极大。与冷冻应缓慢进行不同，解冻应尽可能快速，以确保较高的细胞存活率。

解冻细胞方案
  1. 小心地从液氮中取出细胞。
  2. 立即迅速解冻冻存的细胞。
  3. 冰融化后转移至层流罩中。
  4. 将已解冻细胞逐滴加入盛有预热培养基的离心管中。
  5. 离心细胞悬液，转速与时间因细胞类型而异。
  6. 离心后弃去上清并轻弹沉淀。
  7. 小心重悬于新鲜培养基中，转移至合适大小的烧瓶并孵育。

2.11 支原体检测

支原体是细胞培养实验室最常见的污染物之一，是一类缺乏细胞壁的基本细菌，被认为是最小的自我复制生物。由于体积极小（约 >1 µm），很难检测，往往直到密度极高并导致培养物变质才被发现。

许多生长缓慢的支原体可在未被检测的培养物中长期存在而不引起细胞死亡，却会改变宿主细胞的行为与代谢；慢性感染还可能降低悬浮培养的增殖速率与饱和密度并引起凝集。检测的唯一途径是定期检测：荧光染色（如 Hoechst）、ELISA、PCR、免疫染色、放射自显影或微生物测定。

2.11.1 使用抗生素

细胞培养中应谨慎使用抗生素。长期连续使用会增强耐药性、允许低水平污染存在并掩盖各类污染物；某些抗生素还可能与细胞发生交叉反应，干扰所研究的细胞过程。

3细胞培养设备

细胞培养实验室因研究机构与研究领域不同而差异很大，但都具备一些必不可少的通用设备与要求，其中最重要的是维持无菌、无病原体的环境。以下列出常见设备与材料（并不完整，视研究领域而有所不同）。

基本设备

  • 细胞培养罩（层流罩或生物安全柜）
  • 保温箱（建议使用带湿度的 CO₂ 培养箱）
  • 水浴
  • 离心机
  • 冰箱与冰柜（–20℃）
  • 细胞计数器（自动计数器或血细胞计数板）
  • 倒置显微镜
  • 液氮（N₂）冰箱或冷冻储藏容器
  • 细胞培养容器（烧瓶、培养皿、滚瓶、多孔板）
  • 移液器
  • 注射器与针头
  • 废液/垃圾容器
  • 培养基、血清与试剂
  • 细胞

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