サンドイッチELISA
サンドイッチ ELISA プロトコル
捕捉抗体と検出抗体でタンパク質を挟み込むサンドイッチ ELISA の原理から、プレコート・組み立て型それぞれの詳細プロトコル、検出とデータ解析までを日本語でまとめました。
← 日本語リソースへ戻る1サンドイッチ ELISA とは？
サンドイッチ ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）は、抗体を利用してサンプル中の目的タンパク質・ホルモン・分析物の量を定量する技術です。捕捉抗体と検出抗体がタンパク質の重複しないエピトープに結合してタンパク質を挟み込むため、「サンドイッチ」ELISA と呼ばれます。検出抗体の添加後、TMB などの化学基質を加えて比色シグナルを生成し、ELISA プレートリーダーで測定します。
2サンドイッチ ELISA 抗体
サンドイッチ ELISA には、検出する分析物・必要な特異性・感度に応じて、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用します。
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は複数のエピトープを認識するため、サンプル中の分析物をできるだけ多く捕捉する目的で用いられます。目的タンパク質を捕捉する機会が増えます。
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は単一のエピトープを認識するため、タンパク質の微妙な違いを区別できます。ポリクローナル抗体と比べてデータの一貫性にも優れます。
3サンドイッチ ELISA の利点
| 長所 | 説明 |
|---|---|
| サンプル精製が不要 | 複雑なサンプルでも、精製を必要とせずにタンパク質・分析物を測定できます。 |
| 高い特異性 | 重複しない 2 つのエピトープを認識する捕捉抗体と検出抗体を用いるため、高い特異性が得られます。 |
| 定量が可能 | ウェスタンブロットなど他の抗体法と比べて、サンプル中のタンパク質量を定量できます。 |
サンドイッチ ELISA キット
Assay Genie の PharmaGenie ELISA キットは、製薬・バイオテクノロジー研究のニーズに応える高品質キットです。ISO 9001 品質システムに従って検証されたモノクローナル抗体ペアと試薬に焦点を当てています。
4サンプルの調製と回収
さまざまな種類のサンプルから、サンドイッチ ELISA でタンパク質・分析物量を測定できます。最適な方法でタンパク質を抽出し、回収後できるだけ早く測定するか、指定温度（-20℃／-80℃）で保存し、凍結融解の繰り返しを避けてください。
血清
血清分離チューブを使用する場合、室温で 30 分間凝固させた後、1,000 × g で 10 分間遠心します。血清画分を回収し、すぐに分析するか小分けして -80℃ で保存します。分離チューブを使用しない場合は 2〜8℃ で一晩凝固させてから同様に遠心・回収します。
血漿
EDTA またはヘパリンを抗凝固剤として血漿を採取します。採取から 30 分以内に 4℃・1,000 × g で 15 分間遠心し、血漿画分を回収してすぐに分析するか -80℃ で保存します。過度に溶血したサンプルは使用に適しません。
5プロトコル：プレコートタイプ
捕捉抗体があらかじめプレートにコーティングされたプレコート ELISA キットの手順です。
- コート済みプレートにスタンダード・サンプル・コントロール（ゼロ）ウェルを設定し、位置を記録します。各サンプルは 2 ウェルでの測定を推奨します。ウェル追加前にプレートを 2 回洗浄してください。
- スタンダード溶液 0.1 mL を各スタンダードウェルに添加します。
- サンプル／標準希釈バッファー 0.1 mL をコントロール（ゼロ）ウェルに添加します。
- 希釈したサンプル（血清・血漿・組織ホモジネート等）0.1 mL をサンプルウェルに添加します。
- プレートを密封し、37℃ で 90 分間インキュベートします。
- 内容物を捨て、吸収紙上で軽くたたきます。完全に乾燥させないよう注意し、ウォッシュバッファーで 2 回洗浄します。
- ビオチン標識検出抗体ワーキングソリューション 0.1 mL を各ウェルに添加します（側壁に触れず底に加える）。
- プレートを密封し、37℃ で 60 分間インキュベートします。
- ウォッシュバッファーで 3 回洗浄し、各洗浄の間に 1 分間浸漬します。
- SABC ワーキングソリューション 0.1 mL を各ウェルに加え、密封して 37℃ で 30 分間インキュベートします。
- ウォッシュバッファーで 5 回洗浄し、各洗浄で 1〜2 分間浸漬します。
- TMB 基質 90 µL を各ウェルに加え、遮光下 37℃ で 15〜30 分間インキュベートします（時間は目安）。
- 反応停止液 50 µL を各ウェルに加えてよく混合します。ただちに黄色へ変化します。
- 停止液の添加直後に、マイクロプレートリーダーで 450 nm の吸光度を測定します。
6プロトコル：組み立て型
抗体ペアから自身でアッセイを組み立てるタイプの手順です。まず捕捉抗体をプレートにコーティングします。
- 希釈した捕捉抗体 100 µL を全ウェルに加えます。
- プレートを覆い、4℃ で一晩インキュベートします。
- 液体を吸引し、0.3 mL の洗浄液での洗浄を 2 回行います。
- ブロッキングバッファー 100 µL を全ウェルに加えます。
- プレートを覆い、室温（18〜25℃）で 2 時間インキュベートします。
- 液体を吸引し、0.3 mL の洗浄液での洗浄を 3 回行います。
- すぐに使用しない場合は、室温で 24 時間ベンチ乾燥後、乾燥剤入り密封袋に入れて 2〜8℃ で最大 12 か月保管できます。
- スタンダードカーブ（標準曲線）を準備します。
- 各スタンダード・サンプル・ゼロ（標準希釈バッファー）100 µL を 2 ウェルずつ添加します。
- 希釈した検出抗体 50 µL を全ウェルに加えます。
- プレートを覆い、室温（18〜25℃）で 1 時間インキュベートします。
- 液体を吸引し、0.3 mL の洗浄液で 2 回洗浄します。
- ストレプトアビジン-HRP 溶液 100 µL を全ウェルに加えます。
- プレートを覆い、室温で 30 分間インキュベートします。
- 上記の洗浄ステップを繰り返します。
- 調製した TMB 基質溶液 100 µL を全ウェルに加えます。
- 遮光・室温で 5〜15 分間インキュベートします（アルミホイルで遮光）。
- 反応停止液 100 µL を全ウェルに加えます。
- 直後に 450 nm（参照波長 630 nm、任意）で吸光度を測定します。
7検出とデータ解析
サンドイッチ ELISA では、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）とアルカリホスファターゼ（ALP）が最も広く用いられる標識酵素です。
pNPP（p-ニトロフェニルリン酸）
pNPP は ALP 基質です。添加後、室温で 10〜30 分間インキュベートし、0.75 M NaOH で反応を停止して 405 nm で測定します。
過酸化水素
過酸化水素は HRP の基質であり、反応中に発色します。
TMB（3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン）
TMB は HRP の存在下で過酸化水素が還元されると発色します。硫酸を加えて反応を停止すると、プレートリーダーで 450 nm の波長で測定できる色調変化が生じます。
結果の計算
各ウェルの相対吸光度は次式で求めます：相対 O.D.450 =（各ウェルの O.D.450）−（ゼロウェルの O.D.450）
標準曲線は、各スタンダードの相対 O.D.450（Y 軸）に対して標準液の各濃度（X 軸）をプロットして作成します。サンプル濃度は標準曲線から求めます。CurveExpert 1.3 などの専用ソフトの使用を推奨します。
8関連する日本語ガイド
ELISA ワークフローに役立つ、その他の日本語ガイドもあわせてご覧ください。