ELISAの原理、プロトコル、方法とキット

ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）は、抗体を利用してサンプル中の目的のタンパク質、ホルモン、または分析物の量を定量化する技術です。サンドイッチELISAでは、捕捉抗体を96ウェルプレートの表面に固相化します。その後、目的の因子を含むサンプルを添加し、抗体とサンプルの複合体を形成します。インキュベーションステップに続いて、ウォッシュバッファーを使用してウェルを洗浄し、未結合のサンプルを除去します。そして酵素標識した検出抗体を添加します。再度のインキュベーション後、余分な抗体と非特異的結合タンパク質を除去するために、洗浄を行います。その後、基質を添加すると色の変化が起こります。サンプル中の分析物の量は、色の変化と相関しています。最後に、反応停止液を添加します。サンプルをプレートリーダーで分析し、ソフトウェアにより結果をプロットおよび計算します。

ELISAは、96ウェルまたは384ウェルのポリスチレンプレートで行われます。 タンパク質および抗体は、インキュベーションにより96ウェルELISAプレートに固定できます。 サンドイッチELISAでは、捕捉抗体がELISAプレートに固定されます。 ただし、競合ELISAアッセイでは、対象の因子がELISAプレートに固定されます。 次に、ELISAプレートをBSAブロッキング溶液でブロックし、ELISA中の非特異的タンパク質の結合を防ぎます。

プレートへの抗体または因子の結合により、ウォッシュバッファーによる洗浄可能になり、非特異的に結合する因子の除去が可能になります。

ELISAプレートは平底で、ELISAプレートリーダーで450nmの吸光度を読み取ります（基質にTMBを使用した場合）。

イムノアッセイは、抗体を使用して目的の抗原を検出するアッセイです。 EIA（酵素免疫測定法）は、検出抗体に標識した酵素を利用して、検出と定量を可能にするアッセイです。 EIAの2つの例は、ウエスタンブロットとELISAです。 ウエスタンブロットは、ニトロセルロースまたはPVDFを使用してタンパク質を固定化するEIAです。目的のタンパク質に結合する一次抗体を添加し、続いて酵素標識二次抗体をインキュベートして目的のタンパク質を検出します。 ELISAでは、捕捉抗体をポリスチレンプレートに固定し、目的の因子を含むサンプルをインキュベートした後、検出抗体と、基質であるTMBにより検出し、比色分析を行います。

ELISAでは既知濃度のスタンダードを使用して、決められた範囲内でサンプル（血清、血漿、上清、牛乳、尿）に含まれる因子の量を決定できます。 ELISAでは、既知濃度の因子をサンプル中の検体量の基準として使用します。これらをスタンダードと呼びます。 ELISAでは、スタンダードのストックが通常ng / mLまたはpg / mLの量で提供されます。その後、このストックを6〜7倍の範囲内に段階希釈します。 値をプロットし、標準曲線（スタンダードカーブ）を作成すると、サンプル中の因子の濃度が求められます。

研究者が日々の研究で使用するELISAには主に6つのタイプがあり、最も一般的なのはサンドイッチELISAと競合ELISA，続いてELISpotと間接ELISAです。

サンドイッチELISAは、ELISAの最も一般的な形式であり、捕捉抗体および検出抗体で因子を挟むことにちなんで命名されています。 上記のように、サンドイッチELISAは、ポリスチレンELISAプレートに捕捉抗体を固相化します。 次に、サンプルをELISAプレートのウェルでインキュベートした後、洗浄ステップを行います。 次に、酵素標識検出抗体を加え、さらにインキュベーションを行い、最後に基質と反応停止液を加えて因子の量を測定します。

競合ELISAは、主にホルモンの検出に使用されます。 競合ELISAでは、対象の因子をポリスチレンELISAプレートに固定します。 競合ELISAは、サンプル中の因子が、捕捉抗体のプレート上の固定化因子と競合するプロセスにちなんで命名されています。 したがって、サンプル中の因子の量が多いほどシグナルが減少し、サンドイッチELISAで見られるグラフと逆になります。

ELISpotアッセイは、一般に、ワクチン開発、獣医学研究、単球/マクロファージ/樹状細胞の特性評価に使用されます。 ELISpotの原理はサンドイッチELISAに似ており、プレートは捕捉抗体でコーティングされています。 その後、細胞をELISAプレートで最大3時間インキュベートします（時間はアプリケーションによって異なります）。 次に、細胞によって産生されたサイトカインは、ELISAプレートに固定化された捕捉抗体と結合します。細胞をELISAプレートから洗い流し、検出抗体を加え、そして基質と反応停止液を加え、サイトカインを検出します。

FluoroSpotはELISpotとほぼ同じですが、酵素標識検出抗体を使用する代わりに、蛍光標識抗体を用いて検出と分析を行います。

間接ELISAでは、対象の因子が一次捕捉抗体に結合します。 次に二次抗体を使用して一次抗体と結合させます。 これは、ウエスタンブロットに似ています。

直接ELISAは、酵素標識抗体をサンプル中の因子に直接結合させます。 結合すると、酵素標識抗体は基質と反応して色の変化をもたらし、二次検出抗体不要で因子の定量化を可能にします。

CLIAの原理はサンドイッチアッセイに似ていますが、サンプル検出に発色基質を使用する代わりに、化学発光基質を利用します。基質から化学発光で生成された光子の量は、サンプル中の因子量に比例します。化学発光はルミノメーターによって相対光単位（RLU）で測定されます。

CLIAは通常、低濃度の因子検出に使用されます（検出限界=ゼプトモル10-21 mol）。

In-Cell ELISAは間接的なELISA技術であり、ポリスチレンELISAプレート上で一晩培養および培養された細胞を使用して実行されます。 次に、細胞を固定、透過処理とブロックをします。 次に、酵素標識あるいは蛍光標識された一次抗体を使用して、標的タンパク質を検出します。 蛍光標識された抗体は、蛍光プレートリーダーまたは顕微鏡で検出し、酵素標識二次抗体はプレートリーダーにより検出します。

ELISAの検出ステップは、測定の最後のステップです。生成されるシグナルは因子量に比例します。 ELISAでの検出には放射性物質（ラジオイムノアッセイ）または蛍光タグ、または発色基質の使用といった3つの方法があります。

発色法は、ELISA検出で最も一般的で広く使用されている手法です。酸化すると青色になり、その後に硫酸の添加で黄色に変わるホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）基質のTMB（3、3 '、5、5'-テトラメチルベンジジン）があります。 この発色はプレートリーダーで450nmの波長で測定できます。

化学発光などの他の検出方法は、425 nmの光を発するHRPの基質であるルミノールを使用します。

ELISA Genieでは、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、シグナル伝達タンパク質、その他の1000種類のバイオマーカーを検出するための、すぐに使用可能なプレコートELISAキットと組み立て型ELISAを提供しています。

ELISA Genie ELISAキットには、あらかじめコーティングされたELISAプレート、捕捉および検出抗体、ウォッシュバッファー、スタンダード希釈バッファー、TMB、反応停止液が含まれています。 また、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシなど、さまざまな動物種のキットも提供しています。

ELISA GenieのPharmaGenie ELISAキットは、創薬研究・バイオテック研究のニーズに応えるために設計された高品質のELISAキットです。ISO9001:2000品質システムに従い認証された高品質のモノクローナル抗体ペアと試薬を使用するPharmaGenie ELISAキットは、未来の発見をサポートする優れたアッセイ優れたアッセイです。

• 全ての試薬がISO9001:2000品質システムに準拠して認証されており、精度と信頼性が保証されている
• 天然・組換え抗原の両方を認識
• 試験した他のヒトサイトカインとの交差反応性なし
• NIBSCへの標準キャリブレーション

組み立て型ELISAキットにより、研究者は自身でELISAプレートを作成できます。 組み立て型ELISAキットには抗体ペア（一致する捕捉抗体と検出抗体）およびバッファーが付属しており、自身でプレートにコーティングができます。 ELISA Genieは、SuperSet ELISAキットと呼ばれる高品質の組み立て型ELISAキットを幅広く提供しています。

• 高度に最適化されたモノクローナル抗体ペア。
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• ISO 9001：2000品質システムに従って検証済の試薬。
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• 試験した他のサイトカインとの交差反応性なし。
• NIBSCの標準キャリブレーション。
• 創薬およびバイオテクノロジー研究を念頭に置いて開発されたELISAキット。
• 効率的な研究のためのさまざまなキットサイズ！

ELISAキットは、捕捉抗体と検出抗体にモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用します。 モノクローナル抗体は、単一のエピトープを認識するという利点を持つため、特定の抗原の正確な分析を提供します。 一方でポリクローナル抗体は、より多くの抗原を捕捉するという利点があります。 最近では組換えモノクローナル抗体がELISAキットに使用されているため、特異性と一貫性が向上しています。

ELISA Genie PharmaGenieシリーズのELISAキットは、IL-1 beta、IFN-gamma、　IL-2、IL-4、IL-6、CXCL8/IL-8などの主要なサイトカイン用の高品質モノクローナル抗体を使用して製造されています。

ELISAプレートへのタンパク質の非特異的結合を防ぐため、ブロッキングバッファーを使用してプレートをコーティングします。 ELISAプレートの結合能力は、プレートにコーティングされたタンパク質（Capture Antibody / Antigen）の量よりも高くなっています。 したがって、後続のインキュベーションステップ中における抗体または他のタンパク質の非特異的結合を防ぐために、残りの領域をブロックする必要があります。後続のステップで他のタンパク質または検出抗体と結合したり複合体を形成したりしないタンパク質を使用したブロッキングバッファーが使用されます。ブロッキングバッファーは非特異的タンパク質の結合を防止し、バックグラウンドノイズを低減しS / N比を高めて、ELISAの感度を上げます。

ELISAの開発には、アッセイを最適化し、S / N比を改善するために、いくつかの異なるブロッキングバッファーをテストする必要があります。 タンパク質の非特異的結合に影響を与える可能性のある要因は、タンパク質―タンパク質相互作用の形成です。 ブロックバッファーを最適化する場合の重要なポイントは、S / N比の増加を最適化することです。これは、ターゲット因子を含むサンプルを追加しないコントロールウェルを置くことでわかります。

ブロッキングバッファーを最適化する場合は、抗体と抗原の相互作用を阻害したり、酵素活性を阻害する可能性があるブロッカーを過剰に使用しないことも重要です。 ブロッキングの最適化には、シグナルを最適化するために、いくつかのバッファーをテストします。

ELISAコーティングバッファーは、タンパク質/分析物または抗体をマイクロタイタープレートへ固相化するために使用します。 マイクロタイタープレートへの測定因子/抗体固相化における重要な要因は、コーティングバッファーのpHです。 pH 7.4からpH 9.6の間のコーティングバッファーを選択すると、タンパク質/抗体/測定因子が結合する立体構造に影響を与える恐れがあり、固相化にも影響します。 コーティングバッファーのテストは、固相化抗体の可動性とパフォーマンスの向上に役立ちます。 コーティングバッファーのテストは、SuperSet Development ELISAキット中の1枚のプレートでは、100µlのキャプチャー抗体を10mlのコーティングバッファーに加えます。

インキュベーションステップに続いて、バックグラウンドシグナルを低減するために、結合した非特異的タンパク質および試薬を除去するための洗浄ステップが必要です。 各キットには、指定された量の洗浄ステップが必要です。 洗浄する場合、洗浄ステップの数が不十分であるとバックグラウンドが高くなりますが、逆に過剰洗浄は抗体および/または抗原をELISAプレートから洗い落としてしまう可能性があり、感度とシグナルが低下します。 プレートウォッシャーを使用した自動洗浄は、手動で洗浄ステップを実行するよりも効率的です。

洗浄ステップは、TBS（トリス緩衝生理食塩水）またはPBS（リン酸緩衝生理食塩水）を使用して実行されます。 さらに、0.5％Tween-20を追加して、非特異的な結合タンパク質を除去することができます。

ELISA手順の完了後、次のステップはELISAプレートリーダーを使用してデータを取得して分析することです。

ELISAを実行する場合、結果の統計的有意性を確保するために、サンプルを2つまたは3つのウェルで測定することをお勧めします。 さらに、スタンダードなどのポジティブコントロール、既知のポジティブコントロール、および目的の抗原を含まないブランクまたはサンプルなどのネガティブコントロールが必要になる場合があります。

• ネガティブコントロール：目的因子が含まれないサンプル。
• ポジティブコントロール：目的因子の存在または量が判明しているサンプル。

使用するELISAのタイプ（定性的、半定量的または定量的）に応じて、データ出力が異なります。 したがって、分析したいデータによって、使用するELISAを選択します。 データは、サンプルの対数濃度に対する光学密度（OD）のプロットとして表示されます。 既知濃度のスタンダードを使用して標準曲線を作成し、未知の分析物の濃度を決定します。

変動係数は、結果の不一致と不正確さを識別するのに役立ちます。 平均に対する分散の割合として表されます。 分散が大きいほど、不整合とエラーが大きくなります。 係数変動（CV）は、標準偏差σと平均µの比です。:

Cv= σ/µ

• 高CVは、次の一部またはすべてに起因します。:
• ピペット操作の不正確さ
• 細菌/真菌またはその他の試薬によるサンプルのコンタミネーション。
• 温度変動-ドラフトから離れた安定した温度下でプレートをインキュベートする必要があります。
• ウェルの乾燥-すべてのインキュベーションステップでプレートを覆う必要があります。