ELISAの原理、プロトコル、方法とキット
ELISA の原理、プロトコル、方法とキット
ELISA の基本原理から、プレート・感度・種類・検出戦略・キットの選び方・バッファー・データ解析まで。ELISA を体系的に理解するための日本語ガイドです。
← 日本語リソースへ戻る1ELISA とは？
ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）は、抗体を利用してサンプル中の目的タンパク質・ホルモン・分析物の量を定量する技術です。サンドイッチ ELISA では、まず捕捉抗体を 96 ウェルプレート表面に固相化します。目的因子を含むサンプルを添加して複合体を形成させ、インキュベーション後にウォッシュバッファーで未結合成分を除去します。続いて酵素標識検出抗体を添加し、再度のインキュベーションと洗浄の後に基質を加えると発色が起こります。分析物量は発色の強さと相関します。最後に反応停止液を加え、プレートリーダーで測定してソフトウェアで結果をプロット・計算します。
2ELISA プレート
ELISA は 96 ウェルまたは 384 ウェルのポリスチレンプレートで行います。抗体やタンパク質はインキュベーションによりプレートに固定できます。サンドイッチ ELISA では捕捉抗体を、競合 ELISA では対象因子をプレートに固定します。その後、BSA ブロッキング溶液でプレートをブロックし、非特異的なタンパク質結合を防ぎます。
抗体または因子がプレートに結合することで、ウォッシュバッファーによる洗浄が可能になり、非特異的に結合した因子を除去できます。プレートは平底で、TMB を基質とした場合は 450 nm の吸光度を測定します。
3EIA と ELISA の違い
イムノアッセイは、抗体を用いて目的の抗原を検出するアッセイです。EIA（酵素免疫測定法）は、検出抗体に標識した酵素で検出・定量を行います。EIA の代表例がウエスタンブロットと ELISA です。ウエスタンブロットはニトロセルロースや PVDF にタンパク質を固定し、一次抗体・酵素標識二次抗体で検出します。ELISA では捕捉抗体をポリスチレンプレートに固定し、サンプルをインキュベート後、検出抗体と TMB 基質で比色検出します。
4感度と測定範囲
ELISA では、既知濃度のスタンダードを基準に、決められた範囲内でサンプル（血清・血漿・上清・牛乳・尿など）中の因子量を求めます。スタンダードのストックは通常 ng/mL または pg/mL で提供され、6〜7 段階に段階希釈します。測定値をプロットして標準曲線を作成すると、サンプル中の濃度を求められます。
高感度ヒト ELISA キット
| 分析物 | 測定範囲 | 感度 |
|---|---|---|
| IL-2 | 1.87 – 60 pg/mL | 0.97 pg/mL |
| IL-4 | 0.31 – 10 pg/mL | 0.31 pg/mL |
| IL-6 | 1.56 – 50 pg/mL | 0.80 pg/mL |
| IL-10 | 1.56 – 50 pg/mL | 1.30 pg/mL |
| IL-12p70 | 0.78 – 25 pg/mL | 0.75 pg/mL |
| IFN-γ | 0.78 – 25 pg/mL | 0.69 pg/mL |
5ELISA の種類
研究で用いられる ELISA には主に 6 つのタイプがあり、最も一般的なのはサンドイッチ ELISA と競合 ELISA、続いて ELISpot と間接 ELISA です。
サンドイッチ ELISA
最も一般的な形式で、捕捉抗体と検出抗体で因子を挟むことに由来します。捕捉抗体を固相化し、サンプルをインキュベート・洗浄後、酵素標識検出抗体を加え、基質と反応停止液で因子量を測定します。詳細は サンドイッチ ELISA プロトコル をご覧ください。
競合 ELISA
主にホルモンの検出に使用されます。対象因子をプレートに固定し、サンプル中の因子がプレート上の固定化因子と競合します。サンプル中の因子量が多いほどシグナルは減少し、サンドイッチ ELISA とは逆の曲線になります。
ELISpot / FluoroSpot
ELISpot はワクチン開発や免疫細胞の特性評価に用いられ、原理はサンドイッチ ELISA に似ています。捕捉抗体でコートしたプレートで細胞を培養し、産生されたサイトカインを固定化抗体で捕捉、検出抗体と基質で検出します。FluoroSpot はほぼ同じですが、蛍光標識抗体で検出・解析します。
間接 ELISA / 直接 ELISA
間接 ELISA では対象因子が一次抗体に結合し、二次抗体で一次抗体を検出します（ウエスタンブロットに類似）。直接 ELISA では酵素標識抗体を因子に直接結合させ、二次抗体なしで定量します。
CLIA / In-Cell ELISA
CLIA はサンドイッチ法に似ていますが、化学発光基質を用います。発生した光子量は因子量に比例し、ルミノメーターで相対光単位（RLU）として測定されます。低濃度の検出に適します。In-Cell ELISA は間接的手法で、プレート上で培養した細胞を固定・透過・ブロックし、標識抗体で標的タンパク質を検出します。
マルチプレックス ELISA パネル
複数の分析物を同時に測定したい場合は、マルチプレックス ELISA が便利です。
6検出戦略
検出は測定の最終ステップで、生成されるシグナルは因子量に比例します。検出には放射性標識（ラジオイムノアッセイ）、蛍光タグ、発色基質の 3 つの方法があります。
発色法が最も一般的で広く使われます。HRP 基質の TMB は酸化されると青色になり、硫酸の添加で黄色へ変化し、450 nm で測定します。化学発光法では、HRP 基質のルミノールが 425 nm の光を発します。
7ELISA キットの種類
Assay Genie では、サイトカイン・ケモカイン・ホルモン・シグナル伝達タンパク質など 1000 種類以上のバイオマーカーに対応する、すぐに使えるプレコート ELISA キットと、抗体ペアの組み立て型 ELISA キットを提供しています。
プレコート ELISA キット
あらかじめコートされたプレート、捕捉・検出抗体、ウォッシュバッファー、標準希釈バッファー、TMB、反応停止液が含まれます。ヒト・マウス・ラット・ブタ・ウシなど、さまざまな動物種に対応します。
高感度 PharmaGenie ELISA キット
創薬・バイオテック研究のニーズに応える高品質キットで、ISO 9001 品質システムに準拠して検証されたモノクローナル抗体ペアと試薬を使用します。
- 全試薬が ISO 9001 品質システムに準拠して認証
- 天然・組換え抗原の両方を認識
- 試験した他のヒトサイトカインとの交差反応性なし
- NIBSC への標準キャリブレーション
組み立て型 ELISA キット（抗体ペア）
研究者が自身でプレートを作成できるキットで、一致する捕捉抗体・検出抗体とバッファーが付属します。SuperSet ELISA キットとして幅広く提供しています。
| 特徴 | 組み立て型 ELISA | プレコート ELISA | マルチプレックス ELISA |
|---|---|---|---|
| 検出法 | HRP-TMB | HRP-TMB | PE / APC |
| インキュベーション時間 | 2–3 時間 | 2–3 時間 | 2 時間 |
| 感度 | pg/mL | pg/mL | pg/mL |
| ウェルあたりのターゲット数 | 1 | 1 | 24 |
| 必要な装置 | ELISA プレートリーダー | ELISA プレートリーダー | フローサイトメーター |
8ELISA の抗体タイプ
ELISA キットは、捕捉抗体・検出抗体にモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用します。モノクローナル抗体は単一エピトープを認識するため正確な分析に適し、ポリクローナル抗体はより多くの抗原を捕捉できます。近年は組換えモノクローナル抗体の採用により、特異性と一貫性が向上しています。
Assay Genie の PharmaGenie シリーズは、IL-1β、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、CXCL8/IL-8 などの主要サイトカイン向けに高品質モノクローナル抗体を使用しています。
9ブロッキング・コーティングバッファー
ELISA プレートへのタンパク質の非特異的結合を防ぐため、ブロッキングバッファーでプレートをコートします。ブロッキングは非特異的結合を防ぎ、バックグラウンドを低減して S/N 比を高め、感度を向上させます。過剰なブロッカーは抗原抗体反応や酵素活性を阻害しうるため、複数のバッファーを比較して最適化します。
コーティングバッファーはタンパク質・抗体をプレートに固相化するために使用します。重要な要因は pH で、pH 7.4〜9.6 の範囲で固相化と立体構造に影響します。
| ブロッキングバッファーのレシピ |
|---|
| リン酸緩衝生理食塩水（PBS） |
| 1% BSA |
| コーティングバッファー（1 L） | 分量 |
|---|---|
| Na₂CO₃ | 1.5 g |
| NaHCO₃ | 2.93 g |
| 蒸留水 | 1 L まで（pH 9.6） |
10洗浄ステップ
インキュベーション後、バックグラウンドを下げるために、結合した非特異的タンパク質・試薬を除去する洗浄ステップが必要です。洗浄回数が不足するとバックグラウンドが高くなり、過剰洗浄は抗体・抗原を洗い落として感度が低下します。プレートウォッシャーによる自動洗浄は手動より効率的です。
洗浄には TBS（トリス緩衝生理食塩水）または PBS を使用し、0.5% Tween-20 を加えて非特異的結合タンパク質を除去できます。
11データ解析
測定後は、ELISA プレートリーダーでデータを取得して解析します。統計的有意性を確保するため、各サンプルは 2〜3 ウェルで測定することを推奨します。スタンダードなどのポジティブコントロールと、目的抗原を含まないネガティブコントロールを併せて用います。
- ネガティブコントロール：目的因子を含まないサンプル
- ポジティブコントロール：目的因子の有無または量が既知のサンプル
使用する ELISA のタイプ（定性・半定量・定量）に応じてデータ出力が異なります。データはサンプルの対数濃度に対する吸光度（OD）としてプロットし、既知濃度のスタンダードで標準曲線を作成して未知試料の濃度を求めます。
変動係数（CV）
変動係数は結果のばらつきと不正確さを識別するのに役立ちます。標準偏差 σ と平均 µ の比として CV = σ / µ で表され、分散が大きいほど不整合とエラーが大きくなります。
高い CV の原因には次が含まれます。
- ピペット操作の不正確さ
- 細菌・真菌などによるサンプルのコンタミネーション
- 温度変動（ドラフトを避け安定した温度でインキュベート）
- ウェルの乾燥（インキュベーション中はプレートを覆う）
12関連する日本語ガイド
ELISA ワークフローに役立つ、その他の日本語ガイドもあわせてご覧ください。