37 Western Blotting Troubleshooting Tips - Mandarin
37条蛋白质印迹故障排除提示
蛋白质印迹是一种用于确定样品中是否存在所选蛋白质的技术。此在线蛋白质印迹故障排除指南为如未观察到条带、转移质量不佳和背景本底的问题提供了解决方案。我们的指南为研究人员提供了全面的解决方案和建议，以帮助解决进行蛋白质印迹所遇到的难题。
未观察到条带
| 问题 | 解释 |
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1. 错误的一抗 |
抗体亲和力低甚至无 |
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2. 抗体失活 |
执行斑点印迹 |
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3. 蛋白质浓度不足 |
增加蛋白质量并使用阳性对照 |
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4. 转移不佳 |
确保膜已激活。使用硝酸纤维素膜时，转移缓冲液必须包含甲醇。PVDF膜必须预先用甲醇浸泡 |
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5.转移时间欠佳 |
高分子量蛋白质可能需要更长的转移时间 |
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6. 错误的二抗 |
确认主要的宿主物种和IgG类型 |
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7. 抗体已过期 |
检查所有抗体是否过期 |
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8. 抗体存放不正确 |
确保按照制造商的说明存储所有抗体 |
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9. 叠氮化钠污染 |
叠氮钠污染会抑制HRP信号 |
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10. 一级抗体孵育时间欠佳 |
增加与一抗的孵育时间 |
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11. 不相容的一抗和二抗 |
在两种抗体中保持一致的种类 |
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12. 二抗浓度不足 |
增加一/二抗的浓度 |
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13. .过度清洗 |
减少清洗次数和持续时间 |
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14. 方向错误 |
标记膜以确保正确的方向 |
转移质量差
| 问题 | 解释 |
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15. 膜的选择 |
根据目标蛋白质分子量选择PVDF/硝酸纤维素膜 |
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16. 干膜 |
注意不要让膜或滤纸变干 |
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17. 蛋白质分解不完全 |
确保将最佳凝胶浓度用于目标蛋白质 |
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18. 不正确的样品制备 |
样品必须含有DTT或B-巯基乙醇，并在上样之前先进行加热 |
高背景
| 问题 | 解释 |
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19. 非特异性抗体结合 |
确保使用正确且最特异性的一抗 |
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20. 封闭不足 |
优化封锁时间 |
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21. 抗体浓度欠佳 |
优化抗体浓度 |
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22. 洗涤不足 |
增加执行的清洗次数。增加洗涤缓冲液中使用的Tween20的浓度 |
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23. 错误的膜选择 |
与PVDF相比，硝酸纤维素膜的背景通常较底 |
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24. 胶片曝光过度 |
减少曝光时间 |
太多条带
| 问题 | 解释 |
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25. 非特异性抗体 |
确保使用的抗体对目标蛋白质具有特异性 |
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26. 蛋白质分解 |
使用蛋白酶抑制剂来防止抗原的蛋白水解破坏 |
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27. 凝胶过载 |
用过多的蛋白质使凝胶过载会导致“鬼带”的产生。优化蛋白质浓度。 |
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28. 封闭不足 |
延长封闭时间 |
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29. 低抗原浓度 |
考虑免疫沉淀靶蛋白 |
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30. 非特异性二抗结合 |
仅使用二抗作为对照。如果出现条带，则使用其他二抗 |
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31. 分析物聚集 |
增加DTT浓度 |
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32. 翻译后修饰 |
蛋白质样品具有多种修饰形式，例如乙酰化、甲基化和磷酸化 |
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33. 蛋白质降解 |
目标靶蛋白降解 |
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34. 拼接变体 |
可能导致多个条带的可视化 |
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35. 一抗浓度高 |
使用较低浓度的一抗 |
其他
| 问题 | 解释 |
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36. 未解析的蛋白质 |
分离效率低下。使用高分子量和低分子量蛋白质 |
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37. 凝胶的微笑/弯曲效果 |
电压不正确。温度不一致 |