蛋白质印迹方案的第一步是从细胞或组织中提取蛋白质。目标蛋白必须被溶解以便迁移通过分离凝胶。

所用裂解缓冲液的选择将取决于所需蛋白质的产量和蛋白质的亚细胞定位。包含十二烷基硫酸钠（SDS）和其他离子洗涤剂的裂解缓冲液被认为可以提供最高的蛋白质产量，并且对样品的破坏性最大。还应注意，所用的裂解缓冲液将影响方案中关于其识别的天然或变性蛋白质形式的抗体选择。

含有SDS的裂解缓冲液会对蛋白质产生变性作用，而当抗体只能识别其天然结构的蛋白质时，应使用不含洗涤剂或温和的非离子洗涤剂（例如NP-40和Triton X-100）的缓冲液。有关抗体识别的蛋白质形式的信息，可在制造商提供的数据表中找到。

需要注意的是，当需要保留蛋白质间相互作用时，应使用不含离子和非离子洗涤剂的缓冲液。这可以通过机械剪切来实现。

RIPA（放射免疫沉淀分析）缓冲液用于裂解和提取培养细胞中的蛋白质。RIPA缓冲液是用于全细胞提取物和膜结合蛋白的理想细胞裂解试剂。由于RIPA缓冲液会破坏蛋白质之间的相互作用，因此对于免疫沉淀检测而言可能不是理想的选择。

50mM Tris HCL pH 7.4、50mM NaCl、2mM EDTA、0.1％SDS。新鲜加入的蛋白酶抑制剂（载脂蛋白、亮抑酶肽、DTT和PMSF）

NP-40缓冲液广泛用于细胞质、膜结合和全细胞提取物的提取。NP-40被认为是比RIPA缓冲剂弱的缓冲剂。

150mM 氯化钠、1.0％NP-40（Triton X-100可以代替NP-40）、50 mM Tris，pH 8.0

20mM Tris-HCl，pH 7.5

*所有缓冲液可在4℃下保存数周，在-20℃下保存长达一年。

一旦开始裂解，蛋白质降解也随即开始。为了防止蛋白水解和去磷酸化，必须将样品始终置于冰上。将蛋白酶和磷酸酶抑制剂添加到裂解缓冲液中以减慢该过程。每次必须将这些抑制剂新鲜添加到裂解缓冲液中。

在某些情况下，使用的抗体会识别原生状态的蛋白质，因为所选择的表位可能存在于折叠结构的表面。在这种情况下，无需变性样品，因此应将SDS排除在样品外。此外，还原剂（例如，β-巯基乙醇和DTT）必须远离上样缓冲液和迁移缓冲液。

某些蛋白质需要变性才能使抗体有效发挥作用。热变性将展开蛋白质并使抗体能够结合位于蛋白质3D构象内的其相应表位。蛋白质变性可以使用含有变性剂（例如SDS）的上样缓冲液实现，该缓冲液在95-100°C下加热5分钟

蛋白质印迹样品的标准上样缓冲液是2x Lameli缓冲液。Lameli缓冲液包含β-2-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT），在采用无规卷曲构型并进而使蛋白质变性之前，它们的作用是还原二硫键。Lameli缓冲液中除了甘油使样品更致密外，还有SDS成分，可提供凝胶电泳所需的负电荷。

为了使蛋白质的迁移可视化，通常在上样缓冲液中加入小的阴离子染料分子（如溴酚蓝）。由于染料是阴离子且体积小，它将在待分离混合物中的任何成分中最快迁移，并提供一个迁移前线来监测分离进展。

4％SDS、10％2-巯基乙醇、20％甘油、0.004％溴酚蓝、0.125M Tris HCl。检查pH值并将其调至pH6.8。

一旦样品被溶解，就可以通过凝胶电泳分离确定蛋白的浓度并添加样品的上样缓冲液。

SDS-PAGE凝胶有两部分可用于蛋白质印迹。分离凝胶和堆积凝胶。凝胶的底部和较大部分被称为分离凝胶——是首先倒入的。一旦分离凝胶凝固（需要一个小时），就可以添加堆积凝胶。将堆积凝胶倒在分离凝胶上，将梳子放入该凝胶中。这两种凝胶的基本化学性质是相同的，只是它们的丙烯酰胺浓度和pH不同。

凝胶中使用的丙烯酰胺百分比取决于目标蛋白质的大小和凝胶中所需孔的大小。通常，对于小蛋白，应使用高百分比的凝胶，对于大蛋白，应使用低百分比的凝胶。需要注意的是，随着丙烯酰胺用量的增加，孔径减小。下表概述了基于线性分离范围的推荐凝胶百分比。

凝胶可以购买得到；但是许多研究小组更喜欢自己做。以下是10％堆积凝胶和分离凝胶的样品配方示例。

与所有实验一样，应使用阳性和阴性对照来确定测定的准确性、灵敏性和有效性。这样的装入对照也可用于确保凝胶已均匀装入

分子量标记

使用一系列分子量标记能够确定蛋白质的大小（见下文），并能够监测电泳运行。

电泳后，蛋白质必须从凝胶转移到硝酸纤维素膜或PVDF膜上。最广泛使用的转移方法是电洗脱或电泳转移。该方法依赖于蛋白质与PVDF或硝酸纤维素膜之间的疏水性和静电荷，从而确定蛋白质转移的功效。

将含蛋白质的凝胶与转移膜直接接触，并夹在浸没在导电溶液中的两个电极之间。当施加电场时，蛋白质从凝胶迁移并附着在膜上。现在膜是聚丙烯酰胺凝胶上观察到的蛋白质图案的副本。

*注意——最好总是先探测最弱的抗体，因为处理和剥离可能会使目标蛋白质脱粘。

5.8gTrizma碱、2.9g甘氨酸、0.37gSDS粉、200ml甲醇dH₂0至1L

在添加抗体之前，有必要封闭膜以防止检测抗体的任何非特异性结合。封闭膜可提高测定的灵敏度和信噪比。牛奶和BSA是最常用的封闭剂。

使用的封闭剂将取决于抗体，因为有些抗体已被证明能非特异性地与牛奶结合。用磷酸化敏感性抗体进行探测时，建议使用BSA。

需要注意，如果一抗是针对马、牛、山羊或驴而制成的，那么由于交叉反应或IgG污染的可能性，牛BSA蛋白质或牛奶不能被用于封闭膜。

5％Marvel的TBS-Tween（1X TBS和0.1％v/vtween20）

蛋白质印迹法中的洗涤步骤对于去除任何未结合的试剂并减少背景是必要的。未能正确洗涤会导致较高的背景噪音，过多洗涤则会从印迹上洗脱抗原。

洗涤缓冲液中使用的洗涤剂量可能因测定而异，对于诸如Tween20之类的洗涤剂，其浓度范围为0.05至0.5％。建议制作新鲜的洗涤剂，例如Tween20，因为微生物的生长会导致高背景噪音。此外，由于洗涤剂中含有过氧化物，因此必须使用高纯度的洗涤剂。

• 20 mM Tris, pH 7.5
• 150 mM NaCl
• 01% Tween 20

一旦膜被封闭以防止非特异性结合，就可以用一抗探测了。好的一抗可以识别特定蛋白质或一组蛋白质上的表位。使用的抗体取决于所研究的蛋白质。

选择一抗时，必须考虑许多因素，抗体的物种是否具有特异性，因为不同物种之间的表位可能不同，抗体/蛋白质的相互作用可能对变性条件和翻译后修饰敏感，最后，并不是所有的一抗都适用于蛋白质印迹，是否合适可能需要验证。

与一抗一起孵育后，应将膜用洗涤缓冲液洗涤5次，每次5分钟

通常来说，因为不能检测到一抗，所以必须使用标记的二抗，其与第一抗体结合并能够检测靶抗原。所用二抗的选择可能取决于产生一抗的物种或与一抗相连的标签，例如生物素、组氨酸。例如，如果一抗是未修饰的兔单克隆抗体，则使用的二抗必须是来自非小鼠宿主的抗小鼠二抗。

如上所述，将二抗缀合至不同的显影分子，用于膜检测和化学发光，通常使用HRP或AP，而对于激光捕获则需要荧光团。

制造商通常建议使用抗体的稀释液。然而，抗体的最佳稀释度可以根据测定的规格而变化。与较弱表达的蛋白质和较不敏感的测定相比，表达更强的蛋白质和高灵敏度的测定将需要较少的抗体。使用较少的抗体可降低背景噪音并提高特异性。抗体稀释液通常在洗涤缓冲液中进行。

二抗上的标记类型将决定所使用的开发系统。对于酶标记的抗体（例如HRP和AP），需要化学发光法。如果使用共轭荧光团，则可以立即使用荧光扫描装置。

HRP共轭抗体是应用最广泛的，被认为优于AP共轭物，因为HRP酶的体积较小，且与共轭反应相容，所以酶和抗体都具有特异性活性。此外，HRP底物除了具有高活性速率和稳定性外，还可广泛使用。

AP虽然具有线性反应速率，但所需反应时间的增加往往会导致高背景信号和低信噪比。

从HRP/AP共轭物产生的信号是短暂的，只有在酶-底物反应发生时才会持续存在。充分优化的抗体稀释和足够的底物检测方法可以产生1至24小时的光，可以使用X射线胶片或数字成像设备进行记录。X射线胶片可用于获取半定量数据，但数字成像可检测较宽的动态范围，并可修复蛋白质印迹的定量数据。在化学发光印迹中，获得的信号是可变的，通常被认为是半定量的。

荧光团偶联的抗体所需的步骤更少，因为不使用底物，因此操作流程大大缩短。但是，需要专用设备来检测需要激发光源的信号。红外、近红外和量子点的发展提高了用于蛋白质印迹分析的荧光探针的灵敏度。

与化学发光检测相比，使用荧光检测的一个优势是能够使用一个以上的荧光团进行多路复用。荧光印迹还可在重复实验中获得定量且一致的结果。荧光检测的缺点可能包括由于自身荧光导致的信噪比低以及使用带电荷耦合器件的相机无法放大低表达的蛋白质。

从蛋白质印迹膜上去除一抗和二抗被称为剥离。剥离使研究者能够在印迹上查看超过1种蛋白质，例如目标蛋白质和上样对照。检测还可以用于多个目标，其优点是节省时间和样品。

剥离在PVDF膜上效果最好，因为它具有更大的能力来保持蛋白质附着而不洗脱。建议使用化学发光试剂（例如ECL）进行剥离，因为它们不会弄脏膜，而膜会干扰相似分子量目标的检测。可以剥离和染色膜的次数取决于剥离方案的优化程度。

剥离后，重要的是用缓冲液彻底冲洗膜并在一次抗体孵育之前将其封闭。

有2种不同强度的剥离缓冲液可用于温和或刺激性条件。

温和的剥离缓冲液使用低pH值的甘氨酸溶液解离结合的抗体。低pH通过活性位点的结构改变和失活来去除结合的抗体。

15 g 甘氨酸 1 g SDS 10 mL Tween 20 溶于800ml蒸馏水 调节pH值至2.2 用蒸馏水将体积扩至1L

刺激性剥离主要用于具有高信号强度的印迹。刺激性剥离缓冲液也依赖低pH值来改变抗体结构并释放靶蛋白。在刺激性缓冲液中，这种活性是通过使用含有β-巯基乙醇和SDS等还原剂的中性Tris-HCl溶液来实现的。在搅拌下将此溶液在50–80°C的温度下加热45分钟。应注意SDS和β-巯基乙醇的活性不能逆转，被剥离的抗体也不能恢复。此外，在使用刺激性缓冲液后需要彻底清洗，以防止重新检测抗体变性。

62.5mM Tris-HCL，pH 7.8、100mM 巯基乙醇、2％（w/v）SDS

通过凝胶电泳分离的蛋白质可以通过两种方式进行观察：考马斯染色或铜染色。染色的选择很大程度上取决于蛋白质的下游应用。

考马斯染色用于确定蛋白质是否已均匀地迁移。如果目的不是为了转移，而是为了观察SDS-Page分离的结果，那么考马斯染色只能用于凝胶上，因为考马斯染色不可逆。

如果希望在可视化后转移蛋白质，则应使用铜染色。铜染色据说比考马斯染色更快、更灵敏。

转移的效率和成功可以通过用丽春红染色PVDF或硝酸纤维素膜来评估。用丽春红染色很容易在洗涤后逆转，因此可以进行后续抗体探测。