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Western Blotting Guide - Mandarin

蛋白质印迹（Western Blot）指南（中文） | Assay Genie
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蛋白质印迹（Western Blot）指南

蛋白质印迹完整中文指南：从样品制备、电泳、转移、封闭到抗体孵育、显影与剥离重检测，含各类缓冲液配方与分子量标记参考。

作者：Sean Mac Fhearraigh 博士
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1样品制备——蛋白质提取

蛋白质印迹是一种用于确定样品中是否存在所选蛋白质的技术。首先，通过凝胶电泳根据大小分离蛋白质；此后，通过施加电流将蛋白质转移到膜上（通常为硝酸纤维素膜或 PVDF 膜）。然后用对目标蛋白质具有特异性的抗体对膜进行染色，从而获取有关蛋白质的定性或半定量信息。

与其他基于抗体的检测方法（例如 ELISA）相比，蛋白质印迹更具优势，因为可以根据分子量将与非目标蛋白的交叉反应与目标抗原区分开。

蛋白质印迹方案的第一步是从细胞或组织中提取蛋白质。目标蛋白必须被溶解，以便迁移通过分离凝胶。

所用裂解缓冲液的选择取决于所需蛋白质的产量以及蛋白质的亚细胞定位。包含十二烷基硫酸钠（SDS）和其他离子洗涤剂的裂解缓冲液被认为可提供最高的蛋白质产量，但对样品的破坏性也最大。还应注意，所用裂解缓冲液会影响方案中的抗体选择（即抗体识别的是天然还是变性形式的蛋白质）。

含 SDS 的裂解缓冲液会对蛋白质产生变性作用；当抗体只能识别天然结构的蛋白质时，应使用不含洗涤剂或含温和非离子洗涤剂（例如 NP-40 和 Triton X-100）的缓冲液。有关抗体所识别蛋白质形式的信息，可在制造商提供的数据表中找到。

需要注意的是，当需要保留蛋白质间相互作用时，应使用不含离子和非离子洗涤剂的缓冲液，这可通过机械剪切来实现。

按蛋白质定位推荐的裂解缓冲液

  • 细胞质（细胞骨架结合）—— Tris-Triton
  • 细胞质（可溶性）—— Tris-HCl
  • 膜结合—— NP-40/RIPA
  • 线粒体—— RIPA
  • 核—— RIPA
  • 全细胞—— NP-40/RIPA

1.1 RIPA 缓冲液

RIPA（放射免疫沉淀分析）缓冲液用于裂解和提取培养细胞中的蛋白质。它是用于全细胞提取物和膜结合蛋白的理想细胞裂解试剂。由于 RIPA 缓冲液会破坏蛋白质之间的相互作用，因此对于免疫沉淀检测可能不是理想选择。

1.1.2 样品 RIPA 缓冲液配方

  • 50 mM Tris-HCl，pH 7.4
  • 50 mM NaCl
  • 2 mM EDTA
  • 0.1% SDS
  • 新鲜加入的蛋白酶抑制剂（抑肽酶、亮抑酶肽、DTT 和 PMSF）

1.2 NP-40 缓冲液

NP-40 缓冲液广泛用于细胞质、膜结合和全细胞提取物的提取。NP-40 被认为是比 RIPA 更弱的缓冲剂。

1.2.1 样品 NP-40 缓冲液配方

  • 150 mM 氯化钠
  • 1.0% NP-40（可用 Triton X-100 代替 NP-40）
  • 50 mM Tris，pH 8.0

1.3 Tris-HCl 缓冲液

  • 20 mM Tris-HCl，pH 7.5

1.4 Tris-Triton 缓冲液

  • 10 mM Tris，pH 7.4
  • 100 mM NaCl
  • 1 mM EDTA
  • 1 mM EGTA
  • 1% Triton X-100
  • 10% 甘油
  • 0.1% SDS
  • 0.5% 脱氧胆酸盐
所有缓冲液可在 4℃ 下保存数周，在 –20℃ 下保存长达一年。

1.5 蛋白酶和磷酸酶抑制剂

一旦开始裂解，蛋白质降解也随即开始。为防止蛋白水解和去磷酸化，必须将样品始终置于冰上，并将蛋白酶和磷酸酶抑制剂添加到裂解缓冲液中以减慢该过程。每次都必须将这些抑制剂新鲜加入裂解缓冲液。

抑制剂及其目标酶

  • 抑肽酶—— 胰凝乳蛋白酶、纤溶酶、胰蛋白酶
  • EDTA—— 需要 Mg++ 和 Mn++ 的金属蛋白酶
  • EGTA—— 需要 Ca++ 的金属蛋白酶
  • 亮抑酶肽—— 溶酶体蛋白酶
  • 氟化物—— 丝氨酸/苏氨酸磷酸酶
  • 原钒酸钠—— 酪氨酸磷酸酶
  • 胃抑素 A—— 天冬氨酸蛋白酶
  • PMSF—— 丝氨酸、半胱氨酸蛋白酶

1.6 样品方案——使用 RIPA 缓冲液从细胞培养物中制备细胞裂解液

  1. 用冰冷的 PBS 清洗细胞。
  2. 抽吸去除 PBS。
  3. 加入冰冷的 RIPA 缓冲液（大约每 10⁷ 个细胞 1 毫升）。
  4. 使用无菌移液管尖刮除板上的粘附细胞。
  5. 离心（离心力和时间可根据细胞类型改变）。
  6. 从离心机中取出，置于冰上保存。
  7. 吸取上清液到一个新的管中，保持置于冰上，丢弃沉淀。
  8. 用 Bradford 测定法、Lowry 测定法或二辛可宁酸（BCA）法确定蛋白质浓度，BSA 可作为标准品使用。
  9. 确定蛋白质浓度后，样品即可在 –20℃ 或 –80℃ 下冷冻，或准备上样。

1.7 Bradford 蛋白质测定法

  1. 将每种蛋白质样品的等分试样（2 µl）放入 96 孔板的单独孔中。
  2. 向每个样品中加入 Bradford 试剂（100 µl），确保不引入气泡。
  3. 在室温下轻轻摇动 5 分钟。
  4. 为计算每个样品中的蛋白质浓度，需读取 BSA 标准曲线的吸光度：在 2 mg/ml 到 15 mg/ml 之间制备一系列 BSA 稀释液，加入 96 孔板中的 100 µl Bradford 试剂。
  5. 测量 595 nm 处的吸光度，在 Pro-Max5 酶标仪上针对空白（2 µl 裂解缓冲液、100 µl 染料试剂）于 450 nm 处的参考值进行标准化。
  6. 根据标准曲线计算蛋白质样品的浓度。

1.8 制备样品以装入凝胶

在某些情况下，所用抗体会识别原生状态的蛋白质，因为所选表位可能存在于折叠结构的表面。此时无需变性样品，应将 SDS 排除在样品外；此外，还原剂（例如 β-巯基乙醇和 DTT）必须远离上样缓冲液和迁移缓冲液。

某些蛋白质需要变性才能使抗体有效发挥作用。热变性将展开蛋白质，使抗体能够结合位于蛋白质三维构象内的相应表位。蛋白质变性可使用含变性剂（例如 SDS）的上样缓冲液实现，并在 95–100℃ 下加热 5 分钟。

蛋白质印迹样品的标准上样缓冲液是 2x Laemmli 缓冲液。Laemmli 缓冲液包含 β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT），其作用是在蛋白质采用无规卷曲构型并变性之前还原二硫键。除甘油使样品更致密外，Laemmli 缓冲液中还含有 SDS 成分，可提供凝胶电泳所需的负电荷。

为使蛋白质的迁移可视化，通常在上样缓冲液中加入小的阴离子染料分子（如溴酚蓝）。由于染料呈阴离子且体积小，它会在待分离混合物的任何成分中迁移最快，提供迁移前沿以监测分离进展。

1.8.1 Laemmli 缓冲液配方

  • 4% SDS
  • 10% 2-巯基乙醇
  • 20% 甘油
  • 0.004% 溴酚蓝
  • 0.125 M Tris-HCl（检查并将 pH 调至 6.8）

2电泳

样品被溶解后，即可通过凝胶电泳分离，确定蛋白浓度并添加样品的上样缓冲液。

SDS-PAGE 凝胶有两部分用于蛋白质印迹：分离凝胶和堆积凝胶。凝胶底部较大的部分称为分离凝胶，最先倒入；分离凝胶凝固后（约需一个小时），再倒入堆积凝胶并将梳子放入其中。这两种凝胶的基本化学性质相同，只是丙烯酰胺浓度和 pH 不同。

凝胶中使用的丙烯酰胺百分比取决于目标蛋白质的大小以及凝胶中所需孔的大小。通常对于小蛋白应使用高百分比的凝胶，对于大蛋白应使用低百分比的凝胶。需要注意，随着丙烯酰胺用量增加，孔径减小。以下依据线性分离范围概述推荐的凝胶百分比：

  • 5.0% —— 分离线性范围 57–211 kDa
  • 7.5% —— 分离线性范围 36–94 kDa
  • 10% —— 分离线性范围 16–68 kDa
  • 15% —— 分离线性范围 12–43 kDa

凝胶可以直接购买，但许多研究小组更喜欢自己配制。以下是 10% 堆积凝胶和分离凝胶的样品配方示例。

2.1 10% 分离凝胶配方

  • H₂O —— 5.9 ml
  • 30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 —— 5 ml
  • 1.5 M Tris pH 8.8 —— 3.8 ml
  • 10% SDS —— 150 µl
  • 10% APS —— 150 µl
  • TEMED —— 6 µl

2.2 堆积凝胶配方

  • H₂O —— 2.7 ml
  • 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 —— 670 µl
  • Tris pH 6.8 —— 500 µl
  • 10% SDS —— 40 µl
  • 10% APS —— 40 µl
  • TEMED —— 3 µl

3对照和分子量标记

与所有实验一样，应使用阳性和阴性对照来确定测定的准确性、灵敏性和有效性。这样的上样对照也可用于确保凝胶已被均匀装载。

使用一系列分子量标记能够确定蛋白质的大小，并能够监测电泳运行。下列为常用标记蛋白及其分子量：

全细胞/细胞质蛋白

  • β-肌动蛋白 —— 43 kDa
  • α-肌动蛋白 —— 43 kDa
  • GAPDH —— 30–40 kDa
  • β-微管蛋白 —— 55 kDa
  • α-微管蛋白 —— 55 kDa

高分子量（HMW）

  • 黏着斑蛋白 —— 116 kDa

线粒体

  • VDAC1/porin —— 31 kDa
  • 细胞色素 C 氧化酶 —— 16 kDa

核蛋白

  • lamin B1 —— 66 kDa
  • TATA 结合蛋白 TBP —— 38 kDa
  • PCNA —— 29 kDa
  • 组蛋白 H1
  • 组蛋白 H3

其他样本类型

  • 植物组织：LHCP、APX3
  • 血清样本：转铁蛋白 —— 77 kDa
  • 肌肉样本：SDHA —— 73 kDa
  • 酵母样品：磷酸甘油酸激酶

4用于装入样品和运行凝胶的样品方案

凝胶浇筑
  1. 通过丙烯酰胺凝胶上的 SDS-PAGE 分离蛋白质。所用丙烯酰胺的百分比取决于目标蛋白质的分子大小；本方案中使用 10% 的凝胶。
  2. 将分离凝胶倒入两板之间，使凝胶凝固 1 小时。
  3. 用异丙醇将凝胶调平：取 300 µl 异丙醇小心倒在凝胶顶部。
  4. 凝胶凝固后，在水龙头下轻轻用水冲洗凝胶以除去异丙醇。
  5. 加入堆积凝胶，小心地将梳子放入凝胶中以免产生气泡，让凝胶凝结 1 小时。
上样与运行
  1. 将板放入凝胶电泳仪中，加入 400 ml 1x SDS-PAGE 运行缓冲液（15.1 g TRIZMA、94 g 甘氨酸、50 ml 10% w/v SDS、dH₂O 至 1 升），先加入内槽让其溢流出来，确保不漏。
  2. 移开梳子，必要时用运行缓冲液冲洗孔。
  3. 向选定的孔中加入 8 µl 未染色的分子量阶梯和 20 µl 目标蛋白质样品。
  4. 以 25 mA/凝胶运行凝胶 1 小时 15 分钟。

5蛋白质印迹转移

电泳后，蛋白质必须从凝胶转移到硝酸纤维素膜或 PVDF 膜上。最广泛使用的转移方法是电洗脱或电泳转移，该方法依赖于蛋白质与 PVDF 或硝酸纤维素膜之间的疏水性和静电荷来决定蛋白质转移的功效。

将含蛋白质的凝胶与转移膜直接接触，并夹在浸没于导电溶液中的两个电极之间。施加电场时，蛋白质从凝胶迁移并附着在膜上。此时膜是聚丙烯酰胺凝胶上所观察到蛋白质图案的副本。

最好总是先探测最弱的抗体，因为处理和剥离可能会使目标蛋白质脱粘。

5.1 转移缓冲液配方

  • 5.8 g Trizma 碱
  • 2.9 g 甘氨酸
  • 0.37 g SDS 粉
  • 200 ml 甲醇
  • dH₂O 至 1 L

6封闭

在添加抗体之前，有必要封闭膜以防止检测抗体的任何非特异性结合。封闭膜可提高测定的灵敏度和信噪比。牛奶和 BSA 是最常用的封闭剂。

所用封闭剂取决于抗体，因为有些抗体已被证明能非特异性地与牛奶结合。用磷酸化敏感性抗体进行探测时，建议使用 BSA。

需要注意，如果一抗是针对马、牛、山羊或驴而制成的，那么由于交叉反应或 IgG 污染的可能性，牛 BSA 蛋白或牛奶不能用于封闭膜。

6.1 封闭缓冲液配方

  • 5% Marvel（脱脂奶粉）溶于 TBS-Tween（1X TBS 和 0.1% v/v Tween-20）

7洗涤缓冲液

蛋白质印迹法中的洗涤步骤对于去除任何未结合的试剂并减少背景是必要的。未能正确洗涤会导致较高的背景噪音，过多洗涤则会将抗原从印迹上洗脱。

洗涤缓冲液中使用的洗涤剂量可能因测定而异；对于 Tween-20 之类的洗涤剂，其浓度范围为 0.05–0.5%。建议现配现用（如 Tween-20），因为微生物生长会导致高背景噪音。此外，由于洗涤剂中含有过氧化物，必须使用高纯度的洗涤剂。

7.1 洗涤缓冲液——TBS-T 配方

  • 20 mM Tris，pH 7.5
  • 150 mM NaCl
  • 0.1% Tween-20

8一抗孵育

一旦膜被封闭以防止非特异性结合，就可以用一抗探测。好的一抗可以识别特定蛋白质或一组蛋白质上的表位，所用抗体取决于所研究的蛋白质。

选择一抗时必须考虑许多因素：抗体的物种特异性（不同物种之间的表位可能不同）、抗体/蛋白质相互作用对变性条件和翻译后修饰的敏感性；最后，并非所有一抗都适用于蛋白质印迹，是否合适可能需要验证。

与一抗一起孵育后，应将膜用洗涤缓冲液洗涤 5 次，每次 5 分钟。

9二抗孵育

通常，因为不能直接检测到一抗，所以必须使用标记的二抗，其与第一抗体结合并能够检测靶抗原。所用二抗的选择取决于产生一抗的物种，或与一抗相连的标签（例如生物素、组氨酸）。例如，如果一抗是未修饰的兔单克隆抗体，则使用的二抗必须是来自非小鼠宿主的抗兔二抗。

如上所述，将二抗缀合至不同的显影分子用于膜检测；对于化学发光通常使用 HRP 或 AP，而对于激光捕获则需要荧光团。

10抗体稀释

制造商通常建议抗体的使用稀释度。然而，抗体的最佳稀释度可根据测定的规格而变化。与较弱表达的蛋白质和较不敏感的测定相比，表达更强的蛋白质和高灵敏度的测定所需的抗体较少。使用较少的抗体可降低背景噪音并提高特异性。抗体稀释通常在洗涤缓冲液中进行。

11印迹显影

二抗上的标记类型将决定所使用的显影系统。对于酶标记的抗体（例如 HRP 和 AP）需要化学发光法；如果使用共轭荧光团，则可立即使用荧光扫描装置。

11.1 化学发光

HRP 共轭抗体应用最广泛，被认为优于 AP 共轭物：因为 HRP 酶体积较小且与共轭反应相容，所以酶和抗体都具有特异性活性；此外 HRP 底物除具有高活性速率和稳定性外，还可广泛获得。

AP 虽然具有线性反应速率，但所需反应时间的增加往往会导致高背景信号和低信噪比。

从 HRP/AP 共轭物产生的信号是短暂的，只有在酶-底物反应发生时才会持续存在。充分优化的抗体稀释和足够的底物检测方法可以产生 1 至 24 小时的光，可使用 X 射线胶片或数字成像设备进行记录。X 射线胶片可用于获取半定量数据，但数字成像可检测较宽的动态范围。在化学发光印迹中，获得的信号是可变的，通常被认为是半定量的。

11.2 荧光检测

荧光团偶联的抗体所需步骤更少，因为不使用底物，操作流程大大缩短。但需要专用设备来检测需要激发光源的信号。红外、近红外和量子点的发展提高了用于蛋白质印迹分析的荧光探针的灵敏度。

与化学发光检测相比，使用荧光检测的一个优势是能够使用多个荧光团进行多重检测（多路复用）。荧光印迹还可在重复实验中获得定量且一致的结果。荧光检测的缺点可能包括由于自身荧光导致的信噪比低，以及使用电荷耦合器件的相机无法放大低表达的蛋白质。

11.3 化学发光检测与荧光检测的区别

  • 原理：化学发光用酶标记的二抗（例如 HRP 或 AP）；荧光用荧光团标记的二抗。
  • 检测方法：化学发光为 X 射线胶片曝光/数字成像；荧光为激光扫描成像仪。
  • 多路复用能力：化学发光无；荧光有。
  • 灵敏度：二者均为 +++。
  • 信号持续时间：化学发光数小时；荧光数周至数月。
  • 线性动态范围：化学发光 15 倍（X 射线检测）、3000–4000 倍（数字成像仪）；荧光 >4,000 倍。
  • 定量测量：化学发光酶信号可变且仅为半定量；荧光信号静态且定量。
  • 底物：化学发光用鲁米诺；荧光无需底物。

12印迹剥离和重新检测

从蛋白质印迹膜上去除一抗和二抗被称为剥离。剥离使研究者能够在同一张印迹上查看超过 1 种蛋白质，例如目标蛋白质和上样对照。重新检测还可用于多个目标，其优点是节省时间和样品。

剥离在 PVDF 膜上效果最好，因为它具有更强的能力将蛋白质保持附着而不洗脱。建议使用化学发光试剂（例如 ECL）进行显影后剥离，因为它们不会弄脏膜（弄脏会干扰相似分子量目标的检测）。可以剥离和染色膜的次数取决于剥离方案的优化程度。

剥离后，重要的是用缓冲液彻底冲洗膜，并在一抗孵育之前将其封闭。可用两种不同强度的剥离缓冲液用于温和或刺激性条件。

12.1 温和的剥离缓冲液

温和的剥离缓冲液使用低 pH 值的甘氨酸溶液解离结合的抗体。低 pH 通过活性位点的结构改变和失活来去除结合的抗体。

12.2 温和的剥离缓冲液配方

  • 15 g 甘氨酸
  • 1 g SDS
  • 10 ml Tween-20
  • 溶于 800 ml 蒸馏水，调节 pH 值至 2.2，用蒸馏水将体积定容至 1 L

12.3 刺激性剥离缓冲液

刺激性剥离主要用于具有高信号强度的印迹。刺激性剥离缓冲液也依赖低 pH 值来改变抗体结构并释放靶蛋白，这种活性通过使用含有 β-巯基乙醇和 SDS 等还原剂的中性 Tris-HCl 溶液实现。在搅拌下将此溶液于 50–80℃ 加热 45 分钟。应注意 SDS 和 β-巯基乙醇的活性不能逆转，被剥离的抗体也不能恢复；此外，使用刺激性缓冲液后需彻底清洗，以防止重新检测抗体变性。

12.4 刺激性剥离缓冲液配方

  • 62.5 mM Tris-HCl，pH 7.8
  • 100 mM 巯基乙醇
  • 2% (w/v) SDS

12.5 剥离方案样本

  1. 将 PVDF 膜与剥离缓冲液（62.5 mM Tris-HCl，pH 7.8、100 mM 巯基乙醇、2% w/v SDS）在 50℃ 下孵育 30 分钟。
  2. 在平台摇床上不断搅拌，于室温下洗膜：2 次每次 5 分钟，1 次 10 分钟，再 2 次每次 5 分钟。
  3. 在室温下于封闭溶液中轻轻搅拌孵育 1 小时进行封闭。
  4. 洗涤 2 次每次 5 分钟，然后与适当的一抗和二抗孵育。

13蛋白质凝胶可视化

通过凝胶电泳分离的蛋白质可以通过两种方式观察：考马斯染色或铜染色。染色的选择很大程度上取决于蛋白质的下游应用。

13.1 考马斯染色

考马斯染色用于确定蛋白质是否已均匀迁移。如果目的不是转移而是观察 SDS-PAGE 分离的结果，则考马斯染色只能用于凝胶上，因为考马斯染色不可逆。

13.2 考马斯染色样本方案

  1. 凝胶电泳后，用 40% 蒸馏水、10% 乙酸和 50% 甲醇处理凝胶，这将使蛋白质沉淀。
  2. 将凝胶置于与步骤 1 相同的溶液中，但添加 0.25%（重量）考马斯蓝染色。
  3. 在室温下于振荡器上孵育 4–24 小时。
  4. 在振荡器上将凝胶转移至 67.5% 蒸馏水、7.5% 乙酸和 25% 甲醇的混合物中进行冲洗。
  5. 去除多余染料后，用新鲜的漂洗缓冲液进行更换。
  6. 染料不会与丙烯酰胺结合，并会被洗掉（留下透明的凝胶）。
  7. 染料与凝胶中的蛋白质牢固结合，并显示为蓝色。

13.3 铜染色

如果希望在可视化后转移蛋白质，则应使用铜染色。铜染色据说比考马斯染色更快、更灵敏。

13.4 铜染色样本方案

  1. 电泳后在 ddH₂O 中短暂冲洗凝胶。
  2. 转移至 3 M CuCl₂ 溶液中放置 5–15 分钟。
  3. 用 ddH₂O 清洗凝胶。
  4. 在暗背景下查看。
  5. 可在半透明的蓝色背景中将蛋白质标记为透明区域。
  6. 可视化后，可通过在 0.1–0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0 中洗涤将凝胶去染色。
  7. 将凝胶放入转移缓冲液中，然后继续转移。

14蛋白质膜可视化

转移的效率和成功可以通过用丽春红染色 PVDF 或硝酸纤维素膜来评估。用丽春红染色很容易在洗涤后逆转，因此可以进行后续抗体探测。

14.1 丽春红染色样本方案

  1. 稀释丽春红原液 1:100。
  2. 在搅拌器上孵育 5 分钟。
  3. 用 ddH₂O 洗涤，直到水清澈并且蛋白带可见。
  4. 用 TBST 洗涤膜脱色。
  5. 如果使用 PVDF 膜，用甲醇重新激活膜，然后再用 TBST 清洗。

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