一抗和二抗不匹配。

二抗必须针对产生一抗的物种——抗该物种

该抗体是否适合IHC方案。

使用的抗体可能无法识别天然蛋白质形式。测试非变性和变性的蛋白质印迹，以确保抗体识别非变性抗原

二抗没有在黑暗中保存。

建议避免将二抗暴露在光下。存放在黑暗中

没有足够的一抗结合目标蛋白。

使用更浓缩的抗体溶液或延长孵育时间

目标蛋白质在组织中并非大量存在。

使用更浓缩的抗体溶液

目标蛋白是核蛋白，抗体无法穿透细胞核。

添加渗透步骤，使抗体可以结合抗原

脱蜡不足。

在二甲苯中孵育更长的时间。始终使用新鲜的二甲苯溶液。

福尔马林可能掩盖了抗原。

使用抗原修复方法

PBS污染。

在PBS抗体存储缓冲液中使用防腐剂（例如0.01％叠氮化物），或者使用新鲜的无菌PBS

封闭不足。

增加封闭潜伏期

使用的一抗是浓缩的。

使用更稀的浓度

二抗的非特异性结合。

在没有一抗的情况下进行二级对照

洗涤不足。

在所有步骤之间用PBS洗涤

内源性过氧化物酶活性。

使用H₂O₂等抑制剂

添加的底物过多。

减少底物孵育时间

色原与PBS反应。

使用Tris缓冲液代替PBS进行洗涤

渗透破坏了膜并去除了膜蛋白。

从缓冲液中去除渗透剂

一抗或二抗的浓度过高。

尝试降低抗体浓度和/或孵育时间。

产生与被染色组织相同物种的一抗（例如，在兔组织上测试的兔一抗）。

使用针对组织以外的物种产生的一/二抗

内源性过氧化物酶活性。

使用H₂O₂等抑制剂

切片/细胞已经干涸。

不要让组织切片变干。