Western Blot Sample Protocol - Mandarin
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蛋白质印迹样本方案
完整的 Western blot 中文样本方案：样品制备、SDS-PAGE 凝胶电泳、膜转移、剥离与重新检测，以及所需溶液与试剂配方和实用技巧。
← 返回中文资源中心1简介
蛋白质印迹（Western blot）是一种用于确定样品中是否存在所选蛋白质的技术。首先，通过凝胶电泳根据大小分离蛋白质。此后，利用电流将蛋白质转移到膜上，通常为硝酸纤维素膜或 PVDF 膜。然后用对目标蛋白质具有特异性的抗体对膜进行染色，从而可以获取有关蛋白质的定性或半定量信息。
蛋白质印迹法可用于确定目标蛋白质的大小，并测量所表达蛋白质的量，以及目标蛋白质在经过药物、环境或遗传变化处理后可能经历的翻译后修饰。
2蛋白质印迹样本方案
使用 RIPA 缓冲液或细胞裂解缓冲液提取蛋白质后，可将蛋白质混合物样品上样至 PAGE 凝胶孔中，然后通过凝胶电泳分离蛋白质。电泳后，通过施加电流将蛋白质转移到硝酸纤维素膜或 PVDF 膜上。一旦蛋白质在膜上，就可以用针对目标蛋白质的特异性抗体进行探测，并使用二抗和检测试剂将其可视化。在本指南中可找到蛋白质印迹所需的溶液和试剂配方，以及可以自行修改的样本方案。
3所需的溶液和试剂
- 裂解缓冲液（RIPA 缓冲液）
- 上样缓冲液
- 运行缓冲液
- 转移缓冲液
- TBS-T
- 封闭缓冲液
- 剥离缓冲液
4程序
4.1 样品制备
样品制备
- 在 RIPA 缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.4、5 mM NaF、5 mM 焦磷酸钠、5 mM EDTA 中的 1% v/v NP40）中裂解细胞，并新鲜加入蛋白酶抑制剂（亮抑酶肽、PMSF、正钒酸钠）。
- 收集细胞裂解液，并使用 BCA 或 Bradford 测定法确定蛋白质浓度。
- 取 20 µg 样品，加入等体积的 2× Laemmli 缓冲液。Laemmli 缓冲液中含有 β-巯基乙醇，其作用是还原二硫键，从而使蛋白质变性。
- 将样品在加热块上于 95℃ 变性 5 分钟。
4.2 SDS-PAGE 凝胶电泳分离样品
SDS-PAGE 电泳
- 通过丙烯酰胺凝胶上的 SDS-PAGE 分离蛋白质。所用丙烯酰胺的百分比取决于目标蛋白质的分子大小。该样本方案中使用的是 10% 的凝胶。有关丙烯酰胺浓度与蛋白质最佳分离范围的指南见下表。
- 在两块玻璃板之间倒入分离凝胶，使凝胶凝固 1 小时。
- 用异丙醇将凝胶调平。为此，取 300 µL 异丙醇，小心地倒在凝胶顶部。
- 凝胶凝固后，可在水龙头下轻轻用水冲洗凝胶以除去异丙醇。
- 加入堆积凝胶，并小心地将梳子插入凝胶中，以免产生气泡。让凝胶凝结 1 小时。
- 将玻璃板放入凝胶电泳仪中，加入 400 mL 1× SDS-PAGE 运行缓冲液（15.1 g Trizma、94 g 甘氨酸、50 mL 10% w/v SDS、加 dH₂O 至 1 升），先将其加入内槽，确认不漏液。
- 移开梳子，必要时用运行缓冲液冲洗加样孔。
- 向选定的孔中加入 8 µL 未染色的分子量标准（ladder）和 20 µL 目标蛋白质样品。
- 以 25 mA/凝胶运行凝胶 1 小时 15 分钟。
4.3 凝胶配方参考
表 1：丙烯酰胺凝胶比例（丙烯酰胺浓度 % — 分离线性范围 kDa）
- 5.0% — 57–211 kDa
- 7.5% — 36–94 kDa
- 10% — 16–68 kDa
- 15% — 12–43 kDa
表 2：10% 分离凝胶配方
- H₂O — 5.9 mL
- 30% 丙烯酰胺双酚 — 5 mL
- 1.5 M Tris pH 8.8 — 3.8 mL
- 10% SDS — 150 µL
- 10% APS — 150 µL
- TEMED — 6 µL
表 3：堆积凝胶配方
- H₂O — 2.7 mL
- 丙烯酰胺双酚 — 670 µL
- Tris pH 6.8 — 500 µL
- 10% SDS — 40 µL
- 10% APS — 40 µL
- TEMED — 3 µL
5蛋白质印迹转移
转移步骤
- 从电泳仪上取下玻璃板，将它们放在纸巾上，用刮刀将板子撬开。
- 通过从凝胶底部切一个角来标记凝胶的方向。
- 将凝胶在转移缓冲液中孵育约 10 分钟，以除去洗涤剂。
- 将膜和滤纸切成凝胶尺寸。
- 在冰冷的转移缓冲液（5.8 g Trizma 碱、2.9 g 甘氨酸、0.37 g SDS 粉、200 mL 甲醇，加 dH₂O 至 1 L）中平衡 Whatman 滤纸 15 分钟。
- 在甲醇（100%）中激活聚偏二氟乙烯（PVDF）膜 20 秒，然后用 ddH₂O 洗涤并在转移缓冲液中平衡 15 分钟。
- 将凝胶放在三张 Whatman 滤纸（3 mm）上，然后放上已激活的 PVDF 膜。
- 在顶部再添加三张滤纸。
- 将凝胶放在最靠近黑色面的转移盒中。
- 清除可能形成的任何气泡，使用玻璃管轻轻将气泡滚出。
- 添加最后一个纤维垫，确保其被转移缓冲液完全覆盖。
- 牢牢关闭转移盒，注意不要移动凝胶和滤纸三明治，用白色闩锁将暗盒锁紧。
- 使用槽式转移系统，在 60 V 和 180 mA 下将凝胶中的蛋白质转移 60 分钟到 PVDF 膜上。
- 室温下，在振荡器上用 TBS-T（1× TBS 和 0.1% v/v Tween 20）中的 5% 蛋白质将 PVDF 膜封闭 30 分钟。
- 在与一抗孵育之前，室温下用 TBS-T 洗涤 5 次，每次 5 分钟。
- 加入一抗并在冷藏室中孵育。孵育时间因抗体而异，某些情况下可以过夜。
- 用 TBS-T 洗涤 5 次，每次 5 分钟。
- 用含有酶标记（例如 HRP）的二抗孵育膜。
- 重复步骤 17。
- 使用增强化学发光（ECL）试剂，或在暗室中将膜暴露于 X 射线胶片，使 PVDF 膜上的蛋白条带显影。
- 为确保每个孔上样均等，可对印迹进行微管蛋白或相关管家基因的探测。
6蛋白质印迹剥离和重新检测
剥离与重新检测
- 将 PVDF 膜与剥离缓冲液（62.5 mM Tris-HCl pH 7.8、100 mM 巯基乙醇、2% w/v SDS）在 50℃ 下孵育 30 分钟。
- 在平台摇床上不断搅拌下，室温洗膜：两次每次 5 分钟，一次 10 分钟，再两次每次 5 分钟。
- 室温下，在封闭溶液中轻轻搅拌孵育 1 小时进行封闭。
- 洗涤 2 次每次 5 分钟，然后与适当的一抗和二抗孵育。
7蛋白质印迹溶液与试剂配方
上样缓冲液配方（2×）
- 100 mM Tris-HCl（pH 6.8）
- 200 mM DTT
- 4% SDS
- 0.2% 溴酚蓝
- 20% 甘油
- （应在使用缓冲液前从 1 M 原液中加入 DTT）
运行缓冲液配方
- 15.1 g Trizma
- 94 g 甘氨酸
- 50 mL 10% w/v SDS
- 加 dH₂O 至 1 升
转移缓冲液配方
- 5.8 g Trizma 碱
- 2.9 g 甘氨酸
- 0.37 g SDS 粉末
- 200 mL 甲醇
- 加 dH₂O 至 1 L
TBS-T 配方
- 20 mM Tris，pH 7.5
- 150 mM NaCl
- 0.01% Tween 20
封闭缓冲液
- TBS-T 中的 5% Marvel（脱脂奶粉）
剥离缓冲液
- 62.5 mM Tris-HCl，pH 7.8
- 100 mM 巯基乙醇
- 2% w/v SDS
8帮助提示
- 由于蛋白质印迹需要花费大量时间和精力，因此始终要从高质量的样品开始。不良的蛋白质提取和制备技术将导致不良的印迹结果，更重要的是浪费时间。
- 制作凝胶可能会很麻烦，尤其是当返回后发现凝胶尚未凝固时——可能是因为忘记加入了某种成分。可通过倾斜设备检查凝胶是否凝结，如果仍是液体，最省时的选择通常是重新开始；如条件允许，商业预制凝胶也是一种解决方案。
- 在转移阶段，很容易忘记凝胶而使其干涸，这会导致不良的印迹。电泳之后，为避免这种情况，请始终将凝胶置于一些转移缓冲液中，这样也有时间切割和准备 Whatman 滤纸与 PVDF 膜；也可以批量准备并储存备用。
- 不要低估摇床的转速设置，将其调整到正确的速度（不要太快或太慢）。摇床太快，抗体将无法正确结合；太慢则可能发生不均匀结合。
- 如重复使用抗体，请始终在侧面标记重复使用的次数，这有助于解释印迹为何突然表现异常。
- 确保使用正确的上样对照，但不一定总是 GAPDH；具体取决于样品类型，请参考下表选择建议的上样对照。
提示：上样对照的选择应与样品类型匹配。全细胞/胞质蛋白可用 β-肌动蛋白、α-肌动蛋白（43 kDa）、GAPDH（30–40 kDa）、β/α-微管蛋白（55 kDa），高分子量样品可用黏着斑蛋白（116 kDa）；线粒体样品可用 VDAC1/porin（31 kDa）、细胞色素 C 氧化酶（16 kDa）；核蛋白可用 Lamin B1（66 kDa）、TATA 结合蛋白 TBP（38 kDa）、PCNA（29 kDa）、组蛋白 H1/H3；血清样本可用转铁蛋白（77 kDa）；肌肉样本可用 SDHA（73 kDa）。