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Western Blot Sample Protocol - Mandarin

蛋白质印迹样本方案——引言

蛋白质印迹是一种用于确定样品中是否存在所选蛋白质的技术。首先，通过凝胶电泳根据大小分离蛋白质。此后，通过使用电流将蛋白质转移到通常为硝酸纤维素膜或PVDF的膜上。然后用对目标蛋白质具有特异性的抗体对膜进行染色，从而可以获取有关蛋白质的定性或半定量信息。

蛋白质印迹法可用于确定目标蛋白质的大小，并测量表达的蛋白质的量以及目标蛋白质经过药物、环境或遗传变化处理后可能经历的翻译后修饰。

蛋白质印迹样本方案

使用RIPA缓冲液或细胞裂解缓冲液提取蛋白质后，可将蛋白质混合物样品上样至PAGE凝胶孔中，然后通过凝胶电泳分离蛋白质。电泳后，通过施加电流将蛋白质转移到硝酸纤维素膜或PVDF膜上。一旦蛋白质在膜上，就可以用针对目标蛋白质的特异性抗体进行探测，并使用二抗和检测试剂将其可视化。在本指南中可找到蛋白质印迹所需的溶液和试剂配方，以及可以自行修改的样本方案。

所需的溶液和试剂

  • 裂解缓冲液（RIPA缓冲液）
  • 上样缓冲液
  • 运行缓冲液
  • 转移缓冲液
  • TBS-T
  • 封闭缓冲液
  • 剥离缓冲液

程序

样品制备：

步骤 程序

1.

在RIPA缓冲液（20mM Tris-HCL ph 7.4、5mM NaF、5mM焦磷酸钠、5mM EDTA中的1％v/v NP40）中含有新鲜加入蛋白酶抑制剂（亮抑酶肽、PMSF、正钒酸钠）的裂解细胞降解。请单击此处查看完整方案。

2.

收集细胞裂解液，并使用BCA或Bradford测定法确定蛋白质浓度。

3.

取20ug样品，加入等体积的2x laemmli缓冲液。Lameli缓冲液中含有β-2-巯基乙醇，其作用是减少二硫键，从而使蛋白质变性。

4.

将样品在加热块上于95°C变性5分钟。


SDS-PAGE凝胶电泳分离样品

步骤 程序

1.

通过在丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE分离蛋白质。所用丙烯酰胺的百分比将取决于目标蛋白质的分子大小。该样品方案中使用的是10％的凝胶。在下表中可找到有关丙烯酰胺浓度和蛋白质最佳分离范围的指南。

2.

将两板之间倒入分离凝胶，使凝胶凝固1小时。

3.

用异丙醇将凝胶调平。为此，取用300uL异丙醇，并小心地将倒在凝胶顶部。

4.

凝胶凝固后，可以在水龙头下轻轻用水冲洗凝胶来除去异丙醇。

5.

添加堆积凝胶，并小心地将梳子放入凝胶中，以免产生气泡。让凝胶凝结1小时。

6.

将板放入凝胶电泳仪中，加入400ml 1x SDS-PAGE运行缓冲液（15.1g TRIZMA、94g甘氨酸、50ml10％w/v SDS、dH20至1升），先将其加入室内，让其过流出来，确保不漏。

7.

移开梳子，必要时用运行缓冲液冲洗孔。

8.

向选定的孔中加入8µl未染色的分子量阶梯和20µl目标蛋白质样品。

9.

以25mA/凝胶运行凝胶1小时15分钟

 

表格1：丙烯酰胺凝胶比例

丙烯酰胺浓度％ 分离线性范围（KD）
5.0
57-211
7.5
36-94
10
16-68
15
12-43

 

表格2：10％分离凝胶配方

试剂 剂量
H0
5.9 ml

30% 丙烯酰胺双酚
5 ml
1.5M Tris pH 8.8
3.8 ml
10% SDS
150 µl
10% APS
150 µl
Temed
6 µl

 

表格3：堆积凝胶配方

试剂 剂量
H0
2.7 ml

丙烯酰胺双酚
670 µl
Tris pH 6.8
500 µl
10% SDS
40 µl
10% APS
40 µl
Temed
3 µl


蛋白质印迹转移

步骤 程序

1.

从电泳仪上取下玻璃板，然后将它们放在纸巾上。用刮刀将板子撬开。

2.

通过从凝胶底部切一个角来标记凝胶的方向。

3.

孵育凝胶转移缓冲液约10分钟，以除去洗涤剂。

4.

将膜和滤纸切成凝胶尺寸。

5.

在冰冷的转移缓冲液（5.8g Trizma碱、2.9g甘氨酸、0.37g SDS粉、200ml甲醇dH 2 0至1L）中平衡Whatman滤纸15分钟。

6.

在甲醇（100％）中激活聚偏二氟乙烯（PVDF）膜20秒钟，然后用ddH2O洗涤并在转移缓冲液中平衡15分钟。

7.

将凝胶放在三张Whatman滤纸（3mM）上，然后激活PVDF膜。

8.

在顶部再添加三张滤纸

9.

将凝胶放在最靠近黑色面的转移盒中。

10.

清除可能形成的任何气泡。使用玻璃管轻轻将气泡滚出。

11.

添加最后一个纤维垫。确保沙子被转移缓冲液完全覆盖

12.

牢牢关闭纸盒，注意不要移动凝胶和滤纸三明治。用白色闩锁将暗盒锁紧。

13.

使用槽转移系统在60V和180mA下将凝胶中的蛋白质转移60分钟到PVDF膜上。

14.

室温下，在振荡器上将TDF-Tween（1X TBS和0.1％v/v Tweeen20）中的5％蛋白质与PVDF一起封闭30分钟。

15.

在与一抗孵育之前，在室温下用TBS-T（蛋白质印迹缓冲液）洗涤5次，每次5分钟。

16.

添加一抗并在冷藏室中孵育。持续时间因抗体而异，在某些情况下可以过夜。

17.

用TBS-T洗涤5次，每次5分钟

18.

用含有荧光标记（例如HRP）的二抗孵育膜

19.

重复步骤17

20.

使用增强的化学发光（ECL）试剂或在黑暗的房间中将膜暴露于X射线胶片中，使PVDF膜上的蛋白条带消失

21.

为了确保每个孔均等上样，可以对印迹进行微管蛋白或相关管家基因的探测。


蛋白质印迹剥离和重新检测

步骤 程序

1.

将PVDF膜与剥离缓冲液（62.5mM Tris-HCL，pH 7.8、100mM 巯基乙醇、2％（w/v）SDS）在50°C下孵育30分钟。

2.

在平台摇杆上不断搅拌下，在室温下洗膜两次，每次5分钟，1次10分钟，2次每次5分钟。

3.

在室温下，通过在封闭溶液中轻轻搅拌孵育1小时进行封闭。

4.

洗涤2次每次5分钟，然后与适当的一抗和二抗孵育。


蛋白质印迹溶液与试剂配方

上样缓冲液配方

  • 2X 上样缓冲液：
  • 100mM Tris-HCL (pH6.8)
  • 200mM DTT
  • 4% SDS
  • 0.2%溴酚蓝
  • 20％甘油
  • （应在使用缓冲液之前从1M原液中添加DTT）

运行缓冲液配方

  • 15.1gTRIZMA
  • 94g甘氨酸
  • 50mL10％w / v SDS
  • 多至1升的dH20

转移缓冲液配方

  • 5.8gTrizma碱
  • 2.9g甘氨酸
  • 0.37gSDS粉末
  • 200mL甲醇
  • dH20至1L

TBS-T配方

  • 20 mM Tris, pH 7.5
  • 150 mM NaCl
  • 0.01% Tween 20

封闭缓冲液

  • TBST中的5％Marvel

剥离缓冲液

  • 62.5 mM Tris-HCL,pH 7.8,
  • 100mM 巯基乙醇
  • 2% (w/v) SDS

帮助提示

  • 由于蛋白质印迹需要花费大量时间和精力，因此始终要从高质量的样品开始。不良的蛋白质提取和制备技术将导致不良的蛋白质印迹，更重要的是浪费时间。
  • 制作凝胶可能会很痛苦，尤其是当返回后发现凝胶尚未凝固时——可能是因为忘记添加了一种成分。可以通过倾斜设备来检查凝胶是否凝结，如果仍是液体，最好和最省时的选择是重新开始。如果经济情况允许，商业预制凝胶也可以是一种解决方案。
  • 在转移阶段，很容易会忘记凝胶，使其干涸。这会导致不良的印迹。电泳之后，为避免这种情况，请始终将凝胶放在一些转移缓冲液中。这将让你有时间切割和准备Whatman滤纸和PVDF膜。另外，也可以批量准备这些东西并储存起来，为需要时做准备。
  • 不要低估振动器的设置。将振动器调整到正确的速度（不要太快或太慢）。振动器太快，抗体将无法正确结合，如果太慢，则可能会发生不均匀结合。
  • 如重复使用抗体，请始终在侧面标记重复使用的次数。这可能可以解释为什么印迹表现出色并突然起作用。
  • 确保使用正确的上样控制，但不一定总是GAPDH。具体取决于样品类型，请根据以下列表查看建议的上样控制。
样品类型 蛋白 分子量(kDa)

全细胞/细胞质蛋白

β肌动蛋白
43

α肌动蛋白
43
GAPDH
30-40

β微管蛋白
55

α微管蛋白
55

（高分子量）

黏着斑蛋白
116

线粒体
VDCA1/porin
31

细胞色素C氧化酶
16

核蛋白
lamin B1
66

TATA结合蛋白TBP
38
PCNA
29

组蛋白H1

-

组蛋白H3

-

植物组织
LHCP

-
APX3

-

血清样本

转铁蛋白
77

肌肉样本
SDHA [7]
73

酵母样品

磷酸甘油酸激酶

-