کیت سنجش فعالیت آنزیم تبدیل آنژیوتانسین II (ACE2) (فلورومتریک)

کیت سنجش فعالیت آنزیم تبدیل آنژیوتانسین II (ACE2) (فلورومتریک)

آنزیم مبدل آنژیوتانسین II ، (ACE2, EC 3.4.17.23) یک متالوپروتاز مبتنی بر روی است، بخشی از سیستم رنین-آنژیوتانسین (RAS) است که با پاک کردن دی پپتید ترمینال - Cآنژیوتانسین II ، تنظیم فشار خون را کنترل می کند. ACE2 گیرنده انسداد ویروسهای انسانی مانند SARS و HCoV-NL63 است. در سلولهای اندوتلیال عروقی ریه ، کلیه و قلب بیان می شود.ACE2 یک هدف درمانی بالقوه برای بیماری های قلبی عروقی و عروق کرونا ویروس است. مجموعه کیت سنجش فعالیت تست ژنتیکیACE2 به پیشرفت تحقیقات در این زمینه کمک خواهد کرد. این کیت از توانایی ACE2 فعال در برش بستر پپتید مصنوعی مبتنی بر MCA برای آزاد کردن فلوروفور آزاد بهره می برد. MCA منتشر شده را می توان به راحتی با استفاده از دستگاه میکروپلیت فلورسانس اندازه گیری کرد. ما همچنین یک مهار کننده ویژه ACE2 ارائه می دهیم که می تواند فعالیت ACE2 را از سایر فعالیت های پروتئولیتیک متمایز کند. کیت سنجش ما ساده است و می تواند در یک فرمت توان بالا مورد استفاده قرار گیرد.


Angiotensin II Converting Enzyme (ACE2) Activity Assay Kit (Fluorometric) (BN01071)

داده های سنجش فعالیت ACE2

شکل: (a) MCA -Standard Curve (0-300 pmol) ، میله های خطا SD را نشان می دهند (3 نفر). (ب) منحنی های فعالیت جنبشی با استفاده از مقادیر مختلف کنترل مثبت ACE2 در سنجش. (ج) فعالیت ACE2 برای انواع مختلف نمونه های بافت موش (پروتئین کل در ریه و کلیه ؛ به ترتیب 17 میکروگرم و 23 میکروگرم) و نمونه بافت کلیه انسان (10 میکروگرم پروتئین کل) در حضور (+ مهار کننده) و غیاب ( مهار کننده) از مهار کننده ACE2. (د) فعالیت ACE2 و مهار شده در لیز سلول HEK293 (پروتئین کل: 37 میکروگرم) اندازه گیری شد. سنجش پس از پروتکل کیت انجام شد

ACE2 اجزای کیت سنجش فعالیت

توضیحات اطلاعات کلیدی

BN01071

محصول SKU

100 تست

سایز

فلورومتری (Ex / Em = 320/420 nm)

روش تشخیص

پستانداران

گونه های واکنش پذیری

تشخیص فعالیت ACE2 در لیزات بافت/ سلول و آماده سازی آنزیم.

کاربردها

  • واکنش یک مرحله ای ساده
  • فقط 1-2 ساعت طول می کشد
  • تشخیص فلورسنت غیر رادیومتری HTP قابل تنظیم

ویژگی ها و مزایا

  • ACE2 بافر سنجش
  • ACE2 بافر رقت
  • ACE2بافر لیزر
  • ACE2 کنترل مثبت
  • بستر ACE2
  • (22 میلی متر(مهارکننده ACE2
  • MCA-Standard (1 میلی متر)

اجزای کیت

-20°C

شرایط نگهداری

بسته ژل

شرایط حمل و نقل

فقط برای استفاده از تحقیقات! برای استفاده در انسان نیست.

استفاده

ACE2 عملکرد

 کربوکسیپپتیداز که آنژیوتانسین I را به آنژیوتانسین 1-9 تبدیل می کند ، یک پپتید با عملکرد ناشناخته و آنژیوتانسین II به آنژیوتانسین 1-7 ، وازودیلاتور (PubMed:10969042, PubMed:10924499, PubMed:11815627). همچنین قادر به تجزیه کردن آپلین 13 و دینورفین 13 با راندمان بالا است (PubMed: 11815627). با جدا شدن آنژیوتانسین II ، ممکن است یک تنظیم کننده مهم عملکرد قلب باشد (PubMed: 10969042 ، PubMed: 10924499). با جدا شدن آنژیوتانسین II ، ممکن است نقش مهمی در آسیب حاد ریه ها داشته باشد (با شباهت). نقش مهمی در انتقال اسیدهای آمینه با ایفای نقش به عنوان شریک اتصال دهنده حمل کننده اسید آمینه SL6A19 در روده ، تنظیم فعالیت غیر مجاز ، حالت در سطح سلول و فعالیت کاتالیزوری آن بازی می کند (PubMed: 18424768, ، PubMed: 19185582)

اطلاعات کلیدی ACE2

یونیپروت

ACE2

نام ژن

آنزیم تبدیل آنژیوتانسین 2 ، کربوکسی پپتیداز مربوط به ACE ، هومولوگ آنزیم تبدیل کننده آنژیوتانسین ،ACEH ، متالوپروتاز MPROT15

نامهای جایگزین

ناحیه خارج سلولی یا ترشح شده ، غشای سلولی ، سیتوپلاسم

محل درون سلولی

واقع شده در سلول های اندوتلیال از شریان های کوچک و بزرگ ، و در سلول های عضله صاف شریانی (در سطح پروتئین) (PubMed: 15141377). بیان شده در سلولهای اپیتلیال آلوئول ریه ، انتروسیتهای روده کوچک ، سلولهای لیدیگ و سلولهای سرتولی (در سطح پروتئین) (PubMed: 15141377). بیان شده در لوله پروگزیمال کلیوی و روده کوچک (در سطح پروتئین) (PubMed: 18424768). بیان شده در قلب ، کلیه ، بیضه و دستگاه گوارش (PubMed: 10969042 ، PubMed: 10924499 ، PubMed: 15231706 ، PubMed: 12459472 ، PubMed: 15671045).

ویژگی بافت

در قلب نامنظم تنظیم می شود.

القاء

و کروناویروس ACE2

آنزیم 2 (ACE2) تبدیل کننده آنژیوتانسین مشخص شده است که یک گیرنده عملکردی است که جذب SARS-CoV-2 را به سلول های میزبان تسهیل می کند. (منبع) ACE2 در مکانهای مختلف و انواع سلول بیان شده است ، از جمله سلولهای اپیتلیال آلوئول ، انتروسیتهای سطحی در روده کوچک و سلولهای اندوتلیال قلب و کلیه.

ورود کروناویروس به سلولهای مستعد توسط زیر واحد S1 گلیکوپروتئین تراغشایی کروناویروس صورت میگیرد (معمولاً به اختصار "S" بیان میگردد). (منبع) S1 حاوی یک دامنه اتصال دهنده گیرنده در باقیمانده 318-510 ، که به مانده LYS341 ACE2 با قرابت وابستگی بالا می شناسد متصل می شود. (منبع) وابستگی CoV-2 نسبت به CoV بیشتر است. (منبع)

افزایش میل اتصال به ACE2 انسانی با افزایش راندمان انتقال در شیوع قبلی SARS-CoV ارتباط دارد. (منبع) آنتی بادی های تولید شده علیه SARS-CoV-2 زیر واحد S2 را هدف قرار می دهد ، که مسئول همجوشی غشای ویروسی و میزبان است. بنابراین ، خنثی سازی زیر واحد S2 مانع ورود ویروسی به سلول های آسیب پذیر می شود. (منبع) آنتی بادی های پلی کلونال در برابر پروتئین S از SARS-CoV نشان داده شده است که به طور قابل توجهی توانایی SARS-CoV-2 برای ورود به سلول از طریق ACE2 انسانی کاهش می دهد. (منبع)

-ACE2 کیت سنجش فعالیت پروتکل

روش گام

بافت همگن (100 میلی گرم)) یا سلول های گلوله ای (1-2 10 10 ^ 6) با 400 میکرولیتر لیزر باکتری ACE2 با استفاده از همگن ساز دنس ، به مدت 10 دقیقه روی یخ بگذارید. گردابها را به مدت 10 ثانیه به آرامی و 5 دقیقه دیگر روی یخ نگه دارید. به مدت 10 دقیقه همگن را در دمای 16000 x گرم ، 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ کنید. گلوله ها را دور بریزید.

:آماده سازی محلول

مایع رویی روشن شده را به یک لوله از پیش خنک تمیز منتقل کرده و روی یخ نگه دارید. میزان پروتئین موجود در آنزیم لیزات یا خالص را با استفاده از کیت سنجش پروتئین BCA ، کاهش ماده سازگار اندازه گیری کنید

اندازه گیری غلظت پروتئین

برای نمونه (S) ، 1-5 میکرولیتر لیزین را درون چاه (های) مورد نظر در یک صفحه چاه 96 اضافه کنید. در صورت لزوم ، لیزین را با بافر ACE2 Lysis رقیق کنید. برای کنترل پس زمینه (BC) ، همان حجم بافر لیز را اضافه کنید. برای کنترل مثبت (PC) ، 2 میکرولیتر از کنترل مثبت ACE2 رقیق شده را درون ظرف (های) مورد نظر اضافه کنید. برای کنترل منفی (NC) ، 2 میکرولیتر از مهارکننده ACE2 رقیق شده را به ظرف (های) حاوی نمونه و / یا کنترل مثبت ACE2 اضافه کنید. میزان S ، BC ، NC و PC را با استفاده از تست بافر ACE2 با میزان 50 میکرولیتر در لیتر در روز تنظیم کنید. خوب مخلوط کنید ، به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.

:روش ارزیابی

محلول 25 میکرومولار MCA-Standard را با رقیق کردن 5 میکرولیتر از 1 میلی متر MCA-Standard با 195 میکرولیتر از بافر سنجش ACE2 تهیه کنید. مقدار 0 ، 2 ، 4 ، 6 ، 8 و 10 میکرولیتر 25 میکرومولار MCA-Standard را به یک سری ظرف در یک صفحه ظرف 96 اضافه کنید و با تست بافرACE2 حجم نهایی را به 100 میکرولیتر در ظرف تنظیم کنید. این امر به ترتیب 0 ، 50 ، 100 ، 150 ، 200 و 250 مایع در دقیقه از ظرف MCA Standard تولید می کند. به خوبی مخلوط کرده و فلورسانس (Ex / Em = 320/420 نانومتر) را در یک حالت نقطه پایانی اندازه گیری کنید.

آماده سازی منحنی استاندارد MCA

برای تعداد سنجش هایی که باید انجام شود معرفهای کافی را آماده کنید. برای هر چاه ، 50 میکرولیتر از بستر مخلوط تهیه کنید:

 

  • 48 میکرولیتر لیتر ACE2 Buffer
  • 2 میکرولیتر بستر ACE2

50 میکرولیتر از ACE2 بستر مخلوط را در هر یک از چاه های S ، BC ، PC و NC مخلوط کرده و اضافه کنید. خوب مخلوط کنید.
توجه: مخلوط بستر را به چاه های استاندارد اضافه نکنید.

 

:مخلوط لایه MCA

فلورسانس (Ex / Em 320/420 نانومتر) را در حالت جنبشی به مدت 30 دقیقه تا 2 ساعت در دمای اتاق اندازه گیری کنید. دو نقطه زمان (t1 & t2) را در محدوده خطی طرح انتخاب کنید و مقادیر مربوط به فلورسانس (RFU1 و RFU2) را بدست آورید. ΔRFU / ΔT را محاسبه کنید.

:اندازه گیری

5th Mar 2020 Seán Mac Fhearraigh PhD

Recent Posts