எலிசா இடையகங்களும் சமையல் குறிப்புகளும்

தடுப்பு இடையகம்

தடுப்பு இடையகம் என்பது குறிப்பிட்டு அல்லாத புரதத்தின் கரைசல், புரதம் அல்லது சேர்மம் ஆகியவற்றின் கலவையாகும், இது பூசும் புரதத்தால் ஆக்கிரமிக்கப்படாத தட்டின் மேற்பரப்புகளுடன் குறிப்பிட்டு சொல்ல முடியாத வகையில் ஒட்டிக்கொள்கிறது.

சத்தத்தின் விகிதத்திற்கு பின் புலம் மற்றும் சமிக்ஞையை குறைப்பதன் மூலம் ELISA மதிப்பீட்டின் உணர்திறனை மேம்படுத்தினால், தடுப்பு இடையகங்கள் பயனுள்ளதாக இருக்கும்.

சிறந்த தடுப்பு இடையகங்கள் குறிப்பிட்டு அல்லாத எல்லா தளங்களுக்கும் இருக்கும், இதனால் பின்புலத்தை நீக்கி, ஆன்டிபாடி பிணைப்பிற்கான பகுப்பாய்வு எபிடோப்பை(எதிர்தூண்டித் தீர்வுப்பொருள்) மறைக்காமல் குறிப்பிட்ட சமிக்ஞைகளைக் குறைக்கிறது.

தடுக்கும் இடைமுகத்திற்கான செய்முறை

பாஸ்பேட் பஃபெர்டு சலைன் (பிபிஎஸ்)

1% BSA

பூச்சு இடையகம்

மைக்ரோ டைட்டிர் தட்டுகளில் புரதங்கள் / பகுப்பாய்வு கூறுகள் அல்லது ஆன்டிபாடிகளை நகராமல் தடுப்பதற்கு ELISA பூச்சு இடையகம் பயன்படுத்தப்படுகிறது. மைக்ரோ டைட்டிர் தட்டுகளில் பகுப்பாய்வு கூறுகள் / ஆன்டிபாடிகளை அசையாமல் இருப்பதற்கான முக்கிய காரணிகள் பூச்சு இடையகத்தின் ஹைட்ரோஜென் அயனிச்செறிவாக இருக்கலாம். ஹைட்ரோஜென் அயனிச்செறிவு 7.4 மற்றும் 9.6 க்கு இடையில் இருக்கும் ஒரு பூச்சு இடையகத்தைத் தேர்ந்தெடுப்பது புரதம் / ஆன்டிபாடி / பகுப்பாய்வு கூறு பிணைப்பின் கொள்ளிட விளைவு மீது தாக்கத்தை ஏற்படுத்தக்கூடும், இது அவற்றின் அசையாமையை பாதிக்கும். பூச்சு இடையகங்களை சோதிப்பது அசைவற்ற ஆன்டிபாடிகளின் இயக்கம் மற்றும் செயல்திறனை அதிகரிக்க உதவும்.

பூச்சு இடையகம் தயார் செய்யும் முறை (1 லி)

Na₂CO₂

1.5கி

NaHCO₃

2.93கி

காய்ச்சி வடிகட்டிய நீர்

pH 9.6

பரிந்துரைக்கப்பட்ட அடி மூலக்கூறுகள் மற்றும் நிறுத்த கரைசல்கள்

TMB (டி.எம்.பி)

ஹெச்.ஆர்.பி (குதிரை முள்ளங்கி பெராக்ஸிடேஸ்) இணைந்த நொதிகள் இருப்பில், டி.எம்.பி மற்றும் பெராக்சைடு ஆகியவை ஒரு நீல துணை தயாரிப்பை உருவாக்குகின்றன, இது 605 நானோ மீட்டரில் அதிகப்பட்ச உறிஞ்சும் தன்மையை கொண்டுள்ளது. ஹெச்.ஆர்.பி செயல்பாட்டின் மூலம் உருவாக்கப்படும் வண்ண தீவிரம் ELISA மதிப்பீட்டில் பகுப்பாய்வு கூறுகளின் அளவிற்கு விகிதாசாரமாக இருக்கிறது. டி.எம்.பி (3,3 ’, 5,5’ - டெட்ராமெதில்பென்சிடைன்) அடைகாப்பைத் தொடர்ந்து, எதிர்வினையை நிறுத்த 0.16M சல்பூரிக் அமிலத்தின் நிறுத்த கரைசல் சேர்க்கப்படுகிறது. சேர்க்கப்பட்ட நிறுத்த கரைசலின் அளவு ELISA தட்டின் ஒவ்வொரு குழியிலும் (சோதனை டியூப்களாக பயன்படுத்தக்கூடியவை) சேர்க்கப்படும் டி.எம்.பிஅடி மூலக்கூறின் அளவிற்கு சமமாக இருக்க வேண்டும் (பொதுவாக ஒரு குழிக்கு 50 - 100 uL). அதனைத் தொடர்ந்து கந்தக அமில நிறுத்தக் கரைசலை சேர்க்க வேண்டும். வண்ணம் நீல நிறத்தில் இருந்து மஞ்சள் நிறமாக மாறுகிறது, இது வண்ண வளர்ச்சியை நிலைப்படுத்துகிறது மற்றும் ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டரைப் பயன்படுத்தி 450 நானோமீட்டரில் அடர்த்தியை அளவிட அனுமதிக்கிறது.

pNPP (பி-நைட்ரோஃபெனைல் பாஸ்பேட்)

pNPP என்பது கார பாஸ்பேட்டஸிற்கான குரோமோஜெனிக் அடி மூலக்கூறு ஆகும். கார பாஸ்பேட்-இணைந்த ஆன்டிபாடிகளுடன் பயன்படுத்துவதற்கானpNPP. அல்கலைன்(காரத்தன்மையுடைய) பாஸ்பேட்டஸ் pNPP இன் நீராற்பகுப்பை pNP ஆக்குவதற்கு வினையூக்கியாக செயல்படுகிறது. இது மஞ்சள் பினோலேட் தயாரிப்பை கொடுக்கிறது, இது அதிகபட்சமாக 405nm இல் உறிஞ்சப்படுகிறது. pNNP ஒளிக்கு உணர்திறன் கொண்டது, எனவே அவற்றை பாதுகாப்பாக வைத்திருக்க வேண்டும்.

கழுவும் இடையகம்

ELISA தட்டை கழுவுவதன் குறிக்கோள், சமிக்ஞையை மாற்றும் ஏதேனும் கழிவுகளை அகற்றி, ELISA கூறுகளை பாதுகாப்பதற்காகும். கண்டறிதல் ஆன்டிபாடி சேர்க்கப்பட்டதைத் தொடர்ந்து மற்றும் HRP இணைந்த ஆன்டிபாடி சேர்க்கப்பட்டதைத் தொடர்ந்து, மதிப்பளவுகள் மற்றும் மாதிரிகள் சேர்ப்பதற்கு முன்னர் ELISA தட்டுகள் கழுவப்படுகின்றன.
டிரிஸ் அடிப்படையிலான மற்றும் பிபிஎஸ் அடிப்படையிலான கழுவும் இடையகங்கள் இரண்டையும் எலிசா நெறிமுறைகளில் பயன்படுத்தலாம்.

பிபிஎஸ் கழுவும் இடையகம்

தேவையான பொருட்கள்

பிபிஎஸ்

0.05% V / V டிவீன் -20

டிரிஸ் அடிப்படையிலான கழுவும் இடையகம்

தேவையான பொருட்கள் (1லி இடையகத்திற்கான செய்முறை)

6.06 கிராம் டிரிஸ் பேஸ்

8.2 கிராம் NaCl

6.0 மிலி 6M HCL

1 லி வடிகட்டிய நீர்

pH (ஹைட்ரோஜன் அயனிச்செறிவு) 7.2 முதல் 7.8 ஆகவும், கடத்துத்திறன் 14,000 முதல் 16,000 ஆகவும் இருக்க வேண்டும்

கழுவும் கரைசல்

தேவையான பொருட்கள் (தீர்வு 1 லி)

TBS 1 லி

10% டிவீன் 20 5 லி

Author: Seán Mac Fhearraigh PhD