एलिसा बफर और व्यंजनों

एक ब्लॉकिंग बफर नॉन-स्पेसिफिक प्रोटीन, प्रोटीन या यौगिक के मिश्रण का एक घोल (सॉल्यूशन) होता है जो नॉन-स्पेसिफिक रूप से प्लेट की उन सतहों पर बाइंड करता है जहाँ कोटिंग प्रोटीन द्वारा कब्जा नहीं किया गया है।

ब्लॉकिंग बफर प्रभावी हो सकते हैं यदि वे बैकग्राउंड और नॉइस अनुपात को कम करके एलिसा परीक्षण की संवेदनशीलता (सेंसिटिविटी) को बढ़ाते हैं।

इसलिए बैकग्राउंड को हटाकर, एंटीबॉडी बाइंडिंग के लिए एनालायट एपीटोप को देखे बिना नॉन-स्पेसिफिक सिग्नलों को कम करके, आदर्श ब्लॉकिंग बफर सभी नॉन-स्पेसिफिक साइटों के लिए होगा।

एक एलिसा कोटिंग बफर का उपयोग माइक्रोटाइटर प्लेटों पर प्रोटीन/एनालाइट्स या एंटीबॉडी को स्थिर करने के लिए किया जाता है। माइक्रोटाइटर प्लेटों पर एनालाइट्स/एंटीबॉडी के स्थिरीकरण (इम्मोबिलाईजेशन) में कोटिंग बफर का pH प्रमुख फैक्टर हो सकता है। pH 7.4 और pH 9.6 के बीच का कोटिंग बफर चुनने से प्रोटीन/एंटीबॉडी/ एनालाइट बाइंडिंग की स्टेरिक संरचना पर प्रभाव पड़ सकता है और इस प्रकार उनके स्थिरीकरण (इम्मोबिलाईजेशन ) को प्रभावित कर सकता है। कोटिंग बफर का परीक्षण गतिशीलता और स्थिर एंटीबॉडी के प्रदर्शन को बढ़ाने में मदद कर सकता है।

एचआरपी (हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज) संयुग्मित/कंजूगेटेड एंजाइमों की उपस्थिति में, टीएमबी और पेरोक्साइड प्रतिक्रिया करके एक नीला बाईप्रोडक्ट/उपोत्पाद बनाते हैं, जिसका अधिकतम अवशोषण 605 nm है। एचआरपी गतिविधि द्वारा बनाए गए रंग की तीव्रता/इंटेंसिटी एलिसा परीक्षण में एनालाइट के लेवल के आनुपातिक/प्रोपोर्शनल होती है। TMB (3,3',5,5' - टेट्रामिथाइलबेजिडीन) के इन्क्यूबेशन के बाद प्रतिक्रिया को रोकने के लिए एक स्टॉप सॉल्यूशन 0.16M सल्फ्यूरिक एसिड डाला जाता है। डाले गए स्टॉप सॉल्यूशन की मात्रा एलिसा प्लेट के प्रत्येक वेल (आमतौर पर 50 - 100 uL प्रति वेल) में डाले गए टीएमबी सब्सट्रेट के बराबर होनी चाहिए। स्टॉप सॉल्यूशन सल्फ्यूरिक एसिड के डालने के बाद। रंग नीले से पीले रंग में बदल जाता है, जो रंग के विकास को स्थिर/स्टेबलाइज करता है और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 450nm पर तीव्रता के सटीक माप की अनुमति देता है।

pNPP क्षारीय फॉस्फेटेस के लिए एक क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट है। pNPP क्षारीय फॉस्फेट-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ उपयोग के लिए होता है। क्षारीय फॉस्फेटेज pNPP से pNP में हाइड्रोलिसिस को उत्प्रेरित करता है। इसके परिणामस्वरूप 405nm पर अधिकतम अवशोषण वाला एक पीला फिनोलट बनता है। pNNP प्रकाश के प्रति संवेदनशील है और इस प्रकार इसे प्रकाश से बचाया जाना चाहिए।

एलिसा वॉश का लक्ष्य सिग्नलिंग को बदलने वाली किसी भी मलबे को हटाना और एलिसा घटकों को संरक्षित करना है। एलिसा प्लेटों को मानकों/स्टैण्डर्ड और नमूनों/सैंपल, पता लगाने वाले (डिटेक्शन) एंटीबॉडी और एचआरपी (HRP) संयुग्म एंटीबॉडी को डालने से पहले वॉश किया जाता है। एलिसा प्रोटोकॉल में ट्रिस आधारित और पीबीएस (PBS) आधारित वॉश बफर दोनों का उपयोग किया जा सकता है।