एलिसा परीक्षण (assays) एंटीबॉडी पर आधारित प्रयोग हैं जो शोधकर्ताओं को एक नमूने/सैंपल में मौजूद उनके विश्लेषक/एनालाइट (analyte) की मात्रा पता करने देते हैं। एलिसा परीक्षण (assays) आमतौर पर प्रतिरक्षा विज्ञान, तंत्रिका विज्ञान और कैंसर अनुसंधान में सूजन, विकास कारकों और संकेत/सिग्नल अणुओं से संबधित कई टारगेटों का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है। प्रमुख टारगेट में IL6, IL8, BDNF और VEGF शामिल हैं।

एलिसा के सामान्य प्रकार

सैंडविच एलिसा और प्रतिस्पर्धी एलिसा तकनीक, एलिसा के दो सामान्य प्रकार हैं जिन्हें कि शोधकर्ताओं द्वारा मुख्य रूप से विश्लेषक/एनालाइट (analyte) को मापने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। सैंडविच (प्लेट से बाइंड एंटीबॉडी) और प्रतिस्पर्धी (प्लेट से बाइंड एंटीजन) एलिसा परीक्षणों में दो मुख्य एंटीबॉडी बाइंडिंग कदम शामिल हैं जो कि प्रमुख वॉश चरणों द्वारा अलग होते हैं जो कि दूषित करने वाले कारकों, एंटीबॉडी और कम-बाइंडिंग वाले कॉम्प्लेक्सों को हटाते हैं।

TMB प्रतिक्रिया

एक एलिसा प्रयोग के आउटपुट को मापने के लिए अंतिम एंटीबॉडी-एंटीजन बाउंड कॉम्प्लेक्स का पता लगाने के लिए कई सबस्ट्रेट्स का उपयोग किया जा सकता है। कलरीमेट्रिक, केमिलुमिनिस्सेंट और फ्लोरोसेंट आधारित परीक्षण तीन मुख्य तकनीकें हैं। आमतौर पर एलिसा नमूनों/सैंपल के कलरीमेट्रिक/वर्णमिति आधारित माप को बताता है, जिससे TMB (3,3',5,5'-टेट्रामिथाइलबेंजिडीन) हॉर्स रेडिश पेरोक्साइड की उपस्थिति में हाइड्रोजन पेरोक्साइड से पानी में रिडक्शन के लिए हाइड्रोजन डोनर/दाता के रूप में कार्य करता है। इस प्रतिक्रिया के कारण एक डाईमाइन का उत्पादन होता है जो सोल्यूशन के रंग को नीले रंग में बदल देता है। इस रंग के नीले रंग में बदलने को 370 और 650 nm पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर पढ़ा जा सकता है। इस प्रतिक्रिया को रोकने के लिए सल्फ्यूरिक एसिड को नमूने/सैंपल में मिलाया जाता है और इसके परिणामस्वरूप रंग पीला हो जाता है। एलिसा प्लेट को तब स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है और 450 nm पर पढ़ा जा सकता है।

एलिसा के वॉश चरणों के कारण

एलिसा प्रोटोकॉल में वॉश चरण एक महत्वपूर्ण कदम है। बैकग्राउंड सिग्नल को कम करने के लिए वाशिंग स्टेप्स महत्वपूर्ण हैं, जो अनबाउंड, संयुग्मित एंटीबॉडी से सिग्नल और शोर अनुपात के बढ़ जाने के कारण हो सकते हैं। इसलिए वॉशिंग चरण यह सुनिश्चित करते हैं कि एंटीजन और एंटीबॉडी के बीच केवल उच्च फिडीलिटी बाइंन्डिंग इंटरेक्शन है। जब वॉशिंग ठीक से नहीं होती है, तो इसके कारण बैकग्राउंड काफी ज्यादा हो सकता है, जो डेटा के लेने में बाधा डाल सकता है, जिसके वजह से सैंपलों के बीच काफी भिन्नता, खराब परिणाम आते हैं।

एलिसा वॉशिंग वॉल्यूम & पैरामीटर

एलिसा प्लेट में डाले गए वॉश बफर की मात्रा आपकी प्लेट की सही से वॉशिंग को सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस पर निर्भर करते हुए कि आप एलिसा प्लेट वॉशर या मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करते हैं, अपनी प्लेट को वॉश करते समय आवश्यक मात्रा पर ध्यान दें। वॉशिंग बफर की मात्रा प्रत्येक वेल में डाले गए कोटिंग बफर की मात्रा से अधिक होनी चाहिए। उदाहरण के लिए, यदि आपकी प्लेट को 100µL कोटिंग बफर के साथ कोट किया गया था, तो आपको वेल की अच्छी तरह से वॉशिंग को सुनिश्चित करने के लिए वॉश बफर की एक उच्च मात्रा जैसे कि 200 – 350 µL डालने की आवश्यकता होगी।

एलिसा प्लेट वॉश चक्र

वॉश वॉल्यूम के बाद, वॉश साइकल की संख्या न केवल बैकग्राउंड को अच्छे से हटाने के लिए महत्वपूर्ण है, बल्कि बाइंड किए एंटीजन-एनालाइट की अनावश्यक वॉशिंग को रोकने के लिए भी। यदि सैंपलों को अधिक वॉश किया जाता है, तो यह सिग्नल को कम कर सकता है और मापने और आपके डेटा के विश्लेषण को मुश्किल बना सकता है। प्रोटोकॉल में आपकी स्थिति के आधार पर 1-3-5 वॉशिंग के चरणों की आवश्यकता हो सकती है। सामान्य तौर पर, प्री-कोटेड प्लेटों को DIY कोटेड प्लेटों की तुलना में कम वॉशिंग चरणों की आवश्यकता होती है, हालांकि, यह निर्माता और एलिसा प्लेट को पढ़ने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक पर निर्भर हो सकता है।

एलिसा प्लेट की वॉशिंग के दौरान बफर को निकालना – मैन्युअल

एलिसा प्रोटोकॉल के दौरान बफर को निकालना बचे हुए बफर, अनचाहे कॉम्प्लेक्सों या एंटीबॉडी को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है। मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करते समय, चरणों के बीच मल्टीचैनल पर नयी पिपेट टिप लगाएँ। बफर को निकालते समय, मल्टीचैनल को वेल में तिरछा रखें, जबकि सावधान रहें कि वह बगलों या वेल के तल को न छुए। बफर को हटाने के बाद, आप प्लेट को उल्टा कर सकते हैं और बचे हुए बफर को हटाने के लिए प्लेट को पेपर टॉवल पर टैप कर सकते हैं। वॉशिंग के चरणों और बफर के चरणों के बीच प्लेट को सूखने न दें।