सैंडविच एलिसा (ELISA)
चित्रा 1: एक सैंडविच एलिसा का एक योजनाबद्ध, जिससे कैप्चर एंटीबॉडी और डिटेक्शन एंटीबॉडी ब्याज की प्रोटीन के लिए बाध्य हैं।
सैंडविच एलिसा (ELISA) क्या है?
सैंडविच एलिसा (ELISA) (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) एंटीबॉडी पर आधारित तकनीक है जो रिसर्चरों/शोधकर्ताओं को किसी भी सैंपल में प्रोटीन, हॉर्मोन, या पसंद के एनालाइट की मात्रा पता (quantify) करने देती है। सैंडविच एलिसा इसलिए कहा जाता है क्योंकि कैप्चर (Capture) और डिटेक्शन (detection) एंटीबॉडी प्रोटीन के ऊपर स्थित नॉन-ओवरलैपिंग एपीटोप (epitopes) पर सैंडविच की तरह बाइंड करती हैं। डिटेक्शन एंटीबॉडी मिलाने के बाद, एलिसा प्लेट रीडर के द्वारा पढ़े जाने वाले कलरीमेट्रिक (colorimetric) सिग्नल उत्पन्न करने के लिए एक केमिकल सब्सट्रेट (जैसे कि TMB) मिलाया जाता है।
सैंडविच एलिसा एंटीबॉडीज
स्पेसिफिसिटी, सेंसिटिविटी और जाँच किए जा रहे एनालाइट के आधार पर सैंडविच एलिसा में इस्तेमाल की जाने वाली एंटीबॉडी पॉलीक्लोनल या मोनोक्लोनल हो सकती हैं।
> पॉलीक्लोनल एंटीबॉडीज
पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी को अक्सर एक सैंपल में जितना संभव हो उतने एनालाइट को पुल डाउन के लिए उपयोग किया जाता है। पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी एक एपिटोप पर कई जगह बाइंड कर सकती हैं, इसलिए पसंद की प्रोटीन का पता लगाने के लिए कैप्चर करने की संभावना को बढाती हैं।
> मोनोक्लोनल एंटीबॉडीज
मोनोक्लोनल एंटीबॉडी शोधकर्ताओं को एक अकेले एंटीजन/प्रतिजन को पुल डाउन की अनुमति देती हैं। इसलिए, शोधकर्ताओं को प्रोटीन में सूक्ष्म अंतर को पता लगाने देती हैं। मोनोक्लोनल एंटीबॉडीज, पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी की तुलना में काफी सटीक डेटा भी देती हैं।
सैंडविच एलिसा (ELISA) के फायदे
| फायदे | विवरण |
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सैंपल के शुद्धिकरण/प्यूरीफिकेशन की जरूरत नहीं होती है |
सैंडविच एलिसा परीक्षण जटिल सैंपलों में शुद्धिकरण/प्यूरीफिकेशन की जरूरत के बिना प्रोटीन/एनालाइट को मापने देता है। |
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हाई स्पेसिफिसिटी |
चूँकि कैप्चर और डिटेक्शन एंटीबॉडीज उपयोग की जाती हैं, इसलिए सैंडविच एलिसा परीक्षण में डायरेक्ट या इनडायरेक्ट एलिसा परीक्षण की तुलना में ज्यादा सेंसिटिविटी/संवेदनशीलता होती है। |
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मापना |
दूसरी EIA विधियों जैसे वेस्टर्न ब्लॉट की तुलना में, सैंडविच एलिसा परीक्षण शोधकर्ता को सैंपल में प्रोटीन की मात्रा मापने देता है। |
सैंडविच एलिसा किट
PharmaGenie सैंडविच एलिसा किट
ELISA Genie की PharmaGenie एलिसा किट उच्च गुणवत्ता वाली एलिसा किट हैं जो फार्मा और बायोटेक अनुसंधान की जरूरतों को पूरा करने के लिए डिज़ाइन की गई हैं। उच्च गुणवत्ता वाली मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जोड़े और अभिकर्मकों/रिएजेंट पर ध्यान केंद्रित करते हुए जिन्हें ISO 9001: 2000 गुणवत्ता प्रणालियों के अनुसार मान्य किया गया है, PharmaGenie एलिसा किट हमारे भविष्य की खोज में मदद करने के लिए उत्कृष्ट हैं।
सुपरसेट सैंडविच एलिसा किट (विकास एलिसा किट)
सैंडविच एलिसा वीडियो
ELISA Genie में हमने लोकप्रिय एलिसा किट मानव, माउस और चूहा टारगेट के उपयोग के लिए प्रमुख प्रोटोकॉल सैंडविच एलिसा वीडियो बनाए हैं। ये निर्देशात्मक वीडियो एलिसा प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों पर चर्चा करते हैं, जिससे शोधकर्ताओं को कुशलता से परीक्षण करने में मदद मिलती है। कृपया ध्यान दें, एलिसा किट के आधार पर प्रोटोकॉल थोड़ा भिन्न हो सकता है।
सैंडविच एलिसा प्रोटोकॉल
सैंडविच एलिसा assays शोधकर्ताओं को सीरम, प्लाज्मा, सेल सतह पर तैरनेवाला, ऊतक और अन्य जैविक नमूनों जैसे नमूनों में ब्याज की मात्रा निर्धारित करने में मदद करते हैं। सैंडविच एलिसा किट को दो प्रारूपों में खरीदा जा सकता है, या तो प्री-कोटेड एलिसा प्लेट के रूप में, जिसके द्वारा कैप्चर एंटीबॉडी को पहले से ही पॉलीस्टीरिन एलिसा प्लेट पर लेपित किया जा सकता है, या एंटीबॉडी जोड़े आपके खुद के सैंडा सैंडविच परख को विकसित करने के लिए खरीदे जा सकते हैं। नीचे हम दोनों प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
नमूना तैयार करना और संग्रह करना
सैंडविच एलिसा को कई प्रकार के सैंपलों में प्रोटीन/एनालाइट लेवल मापने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
बढ़िया प्रेक्टिसों के अनुसार, सैंपलों को इकठ्ठा करने के बाद जितनी जल्दी हो सके प्रोटीन निकालें और प्रयोग करें। वैकल्पिक रूप से, अर्क/एक्सट्रेक्ट को बताए गए तापमान (-20°C/-80°C) पर स्टोर करें और बेहतर परिणामों के लिए बार-बार फ्रीज करने-पिघलाने से बचें।
एरुम: यदि सीरम विभाजक ट्यूबों का उपयोग करते हैं, तो नमूनों को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए थक्के लगाने की अनुमति दें। 1,000x जी पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। सीरम अंश और परख तुरंत या विभाज्य लीजिए और -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने की दुकान। कई फ्रीज-पिघलना चक्रों से बचें।
यदि सीरम विभाजक ट्यूबों का उपयोग नहीं किया जा रहा है, तो नमूने को रात में 2-8 डिग्री सेल्सियस पर थक्के लगाने की अनुमति दें। 1,000x जी पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। सीरम और परख तुरंत निकालें या विभाज्य और -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने की दुकान। कई फ्रीज-पिघलना चक्रों से बचें।
प्लाज्मा: एक एंटीकोआगुलेंट के रूप में EDTA या हेपरिन का उपयोग करके प्लाज्मा लीजिए। संग्रह के 30 मिनट के भीतर 1000 × g पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र नमूने। प्लाज्मा अंश और परख तुरंत या विभाज्य लीजिए और -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान। कई फ्रीज-पिघलना चक्रों से बचें। ध्यान दें: अधिक haemolysed नमूने उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं हैं।
विभिन्न नमूना प्रकारों के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कृपया हमारा नमूना संग्रह मार्गदर्शिका देखें।
Sandwich ELISA (pre-coated) protocol step-by-step
चित्रा 3: एक पूर्व-लेपित एलिसा प्लेट के लिए सैंडविच एलिसा प्रोटोकॉल। एक सैंडविच एलिसा परख में शामिल कदमों के लिए कदम से कदम योजनाबद्ध। सबसे पहले, एलिसा प्लेट और इनक्यूबेट के नमूने के अलावा मानकों को तैयार करें। एक बार इनक्यूबेट होने के बाद, लेबल एंटीबॉडी और इनक्यूबेट के अलावा प्लेट को धो लें। ऊष्मायन के बाद, प्लेट को धो लें और SABC कार्यशील समाधान जोड़ें। थाली धो लें और एक ऊष्मायन के बाद, TMB सब्सट्रेट जोड़ें। अंत में स्टॉप सॉल्यूशन और माप जोड़ें।
| कदम | प्रक्रिया |
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1. |
प्री-कोटेड प्लेट पर स्टैण्डर्ड, टेस्ट सैंपल और कंट्रोल (जीरो) वेल सेट करें, और फिर उनकी पोजीशन नोट करें। प्रत्येक स्टैण्डर्ड और सैंपल/नमूने को डुप्लिकेट में मापने की सिफारिश की गई है। स्टैण्डर्ड, सैंपल और कंट्रोल (जीरो) वेल को डालने से पहले प्लेट को 2 बार धोएं/वॉश करें! |
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2. |
0.1 मिली स्टैण्डर्ड सॉल्यूशन को स्टैण्डर्ड वेल में डालें |
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3. |
कंट्रोल (जीरो) वेल में 0.1 मिली सैंपल/स्टैण्डर्ड डायल्यूशन बफर डालें। |
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4. |
0.1 मिली ठीक से पतला किए सैंपल (मानव सीरम, प्लाज्मा, ऊतक homogenates और अन्य जैविक तरल पदार्थ) टेस्ट सैंपल वेल में डालें। |
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5. |
कवर के साथ प्लेट को सील करें और 90 मिनट के लिए 37 °C पर रखें। |
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6. |
कवर निकालें और प्लेट की सामग्री को फेंक दें, प्लेट को शोषक फिल्टर पेपर या अन्य शोषक सामग्री पर रखें। किसी भी समय वेल को पूरी तरह से सूखने न दें। प्लेट को 2 बार वॉश करें। |
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7. |
0.1 मिली बायोटिन-डिटेक्शन एंटीबॉडी वर्किंग सॉल्यूशन को उपरोक्त वेल (स्टैण्डर्ड, टेस्ट सैंपल और जीरो वेल) में डालें। साइड की दीवार को छुए बिना प्रत्येक वेल की तली में सॉल्यूशन डालें। |
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8. |
कवर के साथ प्लेट को सील करें और 60 मिनट के लिए 37 °C पर रखें। |
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9. |
कवर निकालें और प्लेट को वॉश बफर से 3 बार वॉश करें। प्रत्येक वॉश के बीच में वॉश बफर को 1 मिनट के लिए वेल में रहने दें। |
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10. |
0.1 मिली SABC वर्किंग सॉल्यूशन को सभी वेल में डालें, प्लेट को कवर करें और 30 मिनट के लिए 37 °C पर रखें। |
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11. |
कवर निकालें और प्लेट को वॉश बफर के साथ 5 बार वॉश करें और प्रत्येक बार वॉश बफर को वेल में 1-2 मिनट के लिए रहने दें। |
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12. |
90 µl TMB सबस्ट्रेट को प्रत्येक वेल में डालें, प्लेट को कवर करें और 15-30 मिनट के लिए 37 °C पर अंधेरे में रखें ( नोट: रखने का समय केवल संदर्भ के लिए है, अनुकूल समय उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए।) और पहले 3-4 वेल (सबसे ज्यादा सांद्र स्टैण्डर्ड सॉल्यूशन वाले) में नीला रंग देखा जा सकता है और दूसरे वेल में कोई स्पष्ट रंग नहीं दिखता है। |
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13. |
50 µl स्टॉप सॉल्यूशन प्रत्येक वेल में डालें और अच्छे से मिलाएं। तुरंत पीला रंग हो जाएगा। |
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14. |
स्टॉप सॉल्यूशन मिलाने के तुरंत बाद माइक्रोप्लेट रीडर पर 450 nm पर O.D. अवशोषकता (absorbance) को पढ़ें। |
सैंडविच एलिसा (विकास) प्रोटोकॉल कदम से कदम
चित्रा 4: एक विकास एलिसा किट के लिए सैंडविच एलिसा प्रोटोकॉल। एक सैंडविच एलिसा परख में शामिल कदमों के लिए कदम से कदम योजनाबद्ध।
कैप्चर एंटीबॉडी के साथ कोटिंग प्लेट
| कदम | प्रक्रिया |
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1. |
प्रत्येक वेल में पतली/डायल्यूट की हुई 100µl कैप्चर एंटीबॉडी डालें। |
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2. |
प्लास्टिक प्लेट कवर से कवर करें और 4°C पर रात भर रखें |
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3. |
कवर निकालें और प्लेट को इस प्रकार धोएं/वॉश करें: |
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4. |
प्रत्येक वेल में 100µl ब्लॉकिंग बफर डालें |
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5. |
एक प्लास्टिक प्लेट कवर के साथ कवर करें और 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान (18 to 25°C) पर रखें। |
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6. |
कवर निकालें और प्लेट को इस प्रकार धोएं/वॉश करें: |
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7. |
प्लेट के तत्काल उपयोग के लिए अगले खंड के लिए जारी है। यदि आप भविष्य में उपयोग के लिए लेपित और अवरुद्ध प्लेटों को स्टोर करना चाहते हैं, तो प्रत्येक प्लेट को कमरे के तापमान (18 से 25 डिग्री सेल्सियस) पर 24 घंटे के लिए सुखाएं। फिर 12 महीने तक desiccant के साथ एक सील प्लास्टिक की थैली में 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। |
डवलपमेंट सैंडविच एलिसा प्रोटोकॉल
| कदम | प्रक्रिया |
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1. |
स्टैण्डर्ड कर्व/वक्र बनाएं। |
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2. |
स्टैण्डर्ड, सैंपल, जीरो (स्टैण्डर्ड डायल्यूशन बफर) का 100µl प्रत्येक वेल में डुप्लीकेट में डालें। |
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3. |
डायल्युट/पतली की गई डिटेक्शन एंटीबॉडी का 50μl सभी वेल में डालें। |
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4. |
एक प्लास्टिक प्लेट कवर के साथ कवर करें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान (18 to 25°C) पर रखें। |
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5. |
कवर निकालें और प्लेट को इस प्रकार धोएं/वॉश करें: |
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6. |
सभी वेल में 100μl स्ट्रेप्टाविडिन-एचआरपी सॉल्यूशन डालें। |
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7. |
प्लास्टिक प्लेट कवर से कवर करें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (18 to 25°C) पर रखें। |
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8. |
वॉश चरण 5 को दोहराएं। |
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9. |
सभी वैलों में 100μl रेडी-टू-यूज TMB सब्स्ट्रेट सॉल्यूशन डालें। |
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10. |
कमरे के तापमान पर 5-15 मिनट* के लिए अंधेरे में रखें। प्लेट को एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटकर प्रकाश के सीधे संपर्क में आने से बचाएं। |
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11. |
सभी वेल में 100μl स्टॉप अभिकर्मक/रिएजेंट डालें। |
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12. |
(चरण 11 के तुरंत बाद) एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर प्राथमिक तरंग दैर्ध्य 450 nm और संदर्भ तरंग दैर्ध्य (610 nm से 650 nm स्वीकार्य है) 630 nm का उपयोग कर प्रत्येक वेल की अवशोषण मूल्य (absorbance value) को पढ़ें। |
डिटेक्शन और डेटा विश्लेषण
हॉर्स रेडिश परॉक्सीडेज (HRP) & एल्केलाइन फॉस्फेटेस सैंडविच एलिसा विधि द्वारा एनालाइट्स का पता करने के लिए सबसे ज्यादा उपयोग किए जाने वाले एंजाइम हैं और एप्लीकेशन के अनुसार शोधकर्ता को विभिन्न विकल्प प्रदान करते हैं।
P-नाइट्रोफिनाइल-फॉस्फेट (pNPP)
pNPP ALP सब्स्ट्रेट है। pNPP डालने के बाद, सैंपल को कमरे के तापमान पर 10-30 मिनट तक इंकूबेट करें। प्रतिक्रिया को 0.75M NaOH डालकर स्टॉप करें और सैंपलों को 405nm पर रीड करें।
हाइड्रोजन पेरोक्साइड
हाइड्रोजन पेरोक्साइड एचआरपी के लिए सब्सट्रेट है, जो प्रतिक्रिया के दौरान रंग को बदलने की अनुमति देता है।
TMB (3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine)
एचआरपी की उपस्थिति में हाइड्रोजन पेरोक्साइड की कमी के बाद टीएमबी रंग परिवर्तन से गुजरता है। प्रतिक्रिया को बुझाने के लिए, सल्फ्यूरिक एसिड को जोड़ा जाता है और प्रतिक्रिया में रंग परिवर्तन होता है जिसे एक एलिसा प्लेट रीडर द्वारा 450nm पर पढ़ा जा सकता है।
परिणामों की गणना करना
निम्न समीकरण का उपयोग करके गणना करें:
सापेक्ष/रिलेटिव O.D.450 = (प्रत्येक वैल की O.D.450) – (जीरो वैल की O.D.450)
स्टैण्डर्ड/मानक वक्र को प्रत्येक स्टैण्डर्ड सलूशन (Y) के सापेक्ष O.D.450 को बनाम स्टैण्डर्ड सलूशन (X) की संबंधित सांद्रता के रूप में प्लॉट किया जा सकता है। सैंपलों की सांद्रता स्टैण्डर्ड कर्व/वक्र से पता की जा सकती है। प्रोफेशनल सॉफ्टवेयर जैसे कि कर्व एक्सपर्ट 1.3 के उपयोग की सलाह दी जाती है।
नोट: अगर माने गए सैंपलों को पतला/डायल्यूट किया गया था, तो सांद्रता को डायल्यूशन फैक्टर से गुणा करें। डायल्यूशन से पहले सांद्रता पता कर लें।