COVID-19(SARS-CoV-2)トリプレックスRT-qPCR検出キット

COVID-19(SARS-CoV-2)トリプレックスRT-qPCR検出キット

COVID-19アッセイの概要:

この製品は、新規コロナウイルスSARS-CoV-2によって引き起こされる疾患であるCOVID-19を検出するためのマルチプレックス蛍光プローブベースのRT-qPCRアッセイシステムです。 Taqman蛍光プローブは、レポーター-クエンチャーメカニズムに基づく特定のオリゴヌクレオチドです。 各プローブについて、5 '末端はフルオロフォアで標識され、3'末端はクエンチャーで標識されています。 プローブが無傷の場合、フルオロフォアが発する蛍光は消光剤に吸収され、蛍光シグナルは検出されません。 ただし、テンプレートの増幅中に、Taq DNAポリメラーゼの5'-3 'エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが分解され、蛍光レポーターとクエンチャーが切断および分離された場合、蛍光シグナルを検出できます。 各分子単位複製配列の生成は、蛍光シグナルの生成を伴います。 PCRプロセス全体のリアルタイム監視は、蛍光シグナルの蓄積を監視することで評価できます。

この製品は、SARS-CoV-2の2つの独立した遺伝子と、標本の品質を評価するためにヒトRNAse P(RNP)遺伝子を標的とする内部コントロールを含む、単一のチューブでのトリプレックス検出を提供します。 特定のプライマーとプローブは、SARS-CoV-2のORF1ab遺伝子とN遺伝子の保存領域をそれぞれ検出するように設計されており、SARS2003とBatSARSのようなウイルス株の非特異的な干渉を回避しています。 内部統制(RNAse P遺伝子)は、核酸抽出手順の統制と二次的な負の統制を提供します。 ポジティブコントロール(SARS-CoV-2-pseudovirus)は、核酸抽出と逆転写コントロールを提供し、手順全体と試薬の完全性を検証します。

COVID-19(SARS-CoV-2)トリプレックスRT-qPCR検出キットの内容

部品 材料

検出バッファー

900μL×2チューブ

バッファー、dNTP、プライマー、プローブ。

酵素ミックス

400μL×1チューブ

RNase阻害剤、UDG、逆転写酵素、Taq DNAポリメラーゼ。

ポジティブコントロール

250μL×1チューブ

標的遺伝子を含むRNA偽ウイルス。

ネガティブコントロール

250μL×1チューブ

DEPC処理水。

保管および保存期間

  • すべての試薬は遮光して-30℃〜-15℃で保存してください。 試薬は、推奨条件で保管した場合、6か月間安定です。
  • キットを開封して推奨状態で保管した場合、有効期限は変わりません。
  • キットをアイスパックで4日間輸送したり、凍結融解を10回行ったりしても、有効期限は変わりません。

楽器

  • ABI7500、ABI Q3、ABI Q6などのFAM、TEXAS RED / ROXおよびHEX / VICチャネルを備えたリアルタイムPCR機器
  • Roche LightCycler480
  • バイオ・ラッドCFX96

サンプルの取り扱い

  1. 適切な標本タイプ:上気道標本(鼻腔スワブ、鼻咽頭スワブ/吸引物/洗浄液、および痰を含む)および下気道標本(呼吸器吸引物、気管支洗浄液、気管支肺胞洗浄液、および肺生検標本を含む)。
  2. 検体採取の詳細な方法については、「微生物学検体採取マニュアル」のプロトコルを参照してください。
  3. 採取した検体は、同日内の検出に使用してください。 それ以外の場合は、次のように標本を保管してください。
  • 2°C-8°Cで24時間以内で保管してください。
  • -20°C未満で10日間保管してください。
  • 凍結融解を繰り返さないようにして、<-70°Cで長期間保存します。
  • 標本は、ドライアイスを入れた密閉された発泡ボックスを使用して輸送する必要があります。

プロトコル

  1. 標本準備(標本準備エリア)

サンプルは、ウイルスRNA抽出キットの対応する要件と手順に従って抽出する必要があります。 各核酸抽出手順は、1つのポジティブコントロール(5μLを追加、滅菌生理食塩水で目的の容量に希釈)と1つのネガティブコントロール(5μLを追加、滅菌生理食塩水で目的の容量に希釈)と同時に実行する必要があります。 検出に使用されます。 抽出したRNAをすぐに検出に使用しない場合は、凍結融解を繰り返さないように、RNAを-70°C以下で保存してください。

2. 試薬の準備(PCR試薬準備エリア)

必要な試薬を解凍し、振とうして混合し、使用前に軽く遠心します。 次のように、RNaseフリーの遠心チューブで混合物を準備します[1]:

部品 反応あたりの容量(μL)

検出バッファー

26

酵素ミックス

4

全容積

30

[1]反応チューブの数を計算します(サンプル数+陽性対照+陰性対照)。 各テストでネガティブコントロールとポジティブコントロールの両方を設定することをお勧めします。

上記の混合物を完全に混合し、30μLのアリコートを異なるPCR反応チューブに入れます。 次に、標本準備エリアに移動します。

3. テンプレートの追加(標本準備エリア)

20μLの抽出したネガティブコントロール製品、20μLの抽出したポジティブコントロール製品、および20μLの検体からの抽出したRNAを、30μLのPCRミックスを含む異なるPCR反応チューブに追加します。 総容量は50μLです。 反応チューブにしっかりと蓋をし、低速で遠心します。 次に、検出領域に移動します。

4.RT-PCR増幅(検出エリア)

PCR機器に反応チューブを置き、次のサイクリングプロトコルをセットアップして実行します。

ステップ 名前 名前 温度 時間

ステップ1

逆転写

1

50 C°

15分

ステップ2

変性前

1

95 C°

30秒

ステップ3

PCRサイクル

45

95 C°

58 C°(読み取り)

10秒

30秒

検出蛍光の設定:ORF1ab遺伝子(FAM)、N遺伝子(TEXAS RED / ROX)、内部対照(HEX / VIC)。 装置の蛍光の内部参照パラメーターを「なし」に設定してください。 例:ABIシリーズ機器の場合、「パッシブリファレンス」を「なし」に設定してください。

5. データ分析(機器のユーザーマニュアルを参照)

例としてABI7500を取り上げます。qPCR反応後、結果は自動的に保存されました。 分析された画像に従って、ベースラインの開始値、終了値、およびしきい値を調整します(開始値:3〜15;終了値:5〜20;しきい値はログウィンドウで設定でき、しきい値ラインは 増幅曲線の指数関数的フェーズにある;陰性対照の増幅曲線はまっすぐであるか、閾値線より下でなければなりません)。

「分析」をクリックすると、分析結果が自動的に取得され、「レポート」ウィンドウで検出結果が表示されます。

品質管理

チャネル 通常のCtCtなしまたはCt> 38

ネガティブコントロール

FAM

TEXAS RED / ROX

HEX / VIC

CtなしまたはCt> 38

CtなしまたはCt> 38

CtなしまたはCt> 38

ポジティブコントロール

FAM

TEXAS RED / ROX

HEX / VIC

Ct≤33

Ct≤33

Ct≤33

上記のすべての基準が満たされている場合、結果は有効です。 それ以外の場合、結果は無効です。

テスト結果の解釈

品質管理の基準が満たされている場合は、サンプルのデータを次のように分析します。

1. HEX / VIC(内部制御)チャネルのCt値が> 33の場合、検出された検体に含まれる細胞の濃度が低いか、抽出された核酸が分解されたか、反応に特定の阻害剤が存在した可能性があります。

2. HEX / VICチャネルのCt値が33以下の場合、次の表に従って結果を分析します。:

テスト結果の解釈 FAM(ORF1ab遺伝子):CT≤38 FAM(ORF1ab遺伝子):CTなしまたはCT> 38

TEXAS RED / ROX(N遺伝子)

CT≤38

2019-nCOVプラス

再度テストし、繰り返された場合:2019-nCOVネガティブ。

そうでない場合:不審*

TEXAS RED / ROX(N遺伝子)

CTなしまたはCT> 38

再度テストし、繰り返される場合:2019-nCOV;

そうでない場合:不審*

2019-nCOVネガティブ

*サンプルがウイルス培養から抽出された場合、HEX / VICチャネルテスト結果は必要ありません。

*疑わしいサンプルについては、検体を再収集するか、収集場所を変更してから、検体を再度テストすることをお勧めします。

アッセイの制限

  • この製品の検出結果は臨床参照用であり、臨床診断と治療の唯一の証拠として使用するべきではありません。 患者の臨床管理は、症状/徴候、病歴、他の臨床検査および治療反応と組み合わせて検討する必要があります。
  • 検出結果は臨床診断のエビデンスとして直接使用するべきではなく、臨床医の参照のみを目的としています。
  • 検体の採取、保管、輸送などの操作により、検出結果が影響を受けることがあります。 操作に誤りがあると、偽陰性の結果となる場合があります。 検体処理中の相互汚染は、偽陽性の結果につながる可能性があります。
  • これらの製品の検出されたターゲット配列は、2019-nCoVのORF1ab遺伝子とN遺伝子の保存領域です。 ただし、ターゲットシーケンスのバリエーションは、偽陰性の結果につながる可能性があります。
  • このキットは研究専用です。

性能仕様

  1. 検出限界:200コピー/ mL。
  2. 精度:バッチ内およびバッチ間検出に高精度リファレンスCV1およびCV2を使用すると、それらのCt値の変動係数(CV)は5.0%以下です。
  3. ネガティブコントロールの適合率:100%
  4. Positive Controlの適合率:100%
  5. 特異性:インフルエンザAウイルス(H1N1、H3N2、H7N9、H5N1)、インフルエンザBウイルス(山形、ビクトリア)、呼吸器合胞体ウイルス(タイプB)、呼吸器アデノウイルス(タイプ3、タイプ7)、インフルエンザ菌の非特異的干渉、 黄色ブドウ球菌、肺炎球菌など

注意:

  • 実験を始める前に本書をよくお読みになり、指示に従ってください。
  • この製品は、安全が保護された実験室で訓練を受けた労働者のみが使用し、適切な保護具を着用する必要があります。
  • この製品は光から保護する必要があります。 検出時には、滅菌済み、DNaseフリー、RNaseフリーのチューブとチップを使用してください。
  • この製品のテストされた検体は感染性物質と見なされます。
  • 操作と治療は、地域の規制と法律の要件を満たす必要があります。

Additional COVID-19 resources

29th Apr 2020 sean@reagentbio.com BigCommerce

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