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Recommandations calcul resultats ELISA

Lors de la réalisation d’un test ELISA, il est recommandé de faire des réplicas de chaque échantillon testé afin de s’assurer de la validité statistique des résultats (puits en duplicata ou triplicata).

Inclure des contrôles positifs et négatifs lors de la mise en place du test ELISA :

  • Contrôles négatifs : échantillons dépourvus de l’analyte recherché ;
  • Contrôles positifs : échantillons ayant une présence (ou une quantité) connue de l’analyte.


En fonction du type de test ELISA utilisé (qualitatif, semi-quantitatif ou quantitatif), les données brutes générées vont varier. Il convient donc de choisir un test ELISA spécifiquement en fonction des paramètres à analyser. Les données brutes se présentent habituellement sous la forme d’un graphe représentant la densité optique (O.D) en fonction du logarithme de la concentration des échantillons. Des échantillons standards ayant une concentration connue de l’analyte recherché sont utilisés pour établir une courbe standard à partir de laquelle la concentration inconnue de l’analyte dans les échantillons tests peut être calculée.

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Préparer une courbe standard ELISA

Une fois votre protocole ELISA terminé, et les échantillons tests et standards analysés à l’aide d’un lecteur de plaque, vous pouvez tracer la courbe standard de l’analyte recherché. Pour cela, tracez un graphe représentant l’absorbance moyenne (axe des ordonnées) en fonction de la concentration connue (axe des abscisses) de vos échantillons standards. Utilisez un ordinateur pour tracer la meilleure régression mathématique approximant vos données.

Courbe standard d’un test ELISA “en sandwich” : exemple d’une courbe standard d’ELISA “en sandwich” pour le kit ELISA CD8 alpha humain. La densité optique lue à 450nm (OD450) corrèle avec la concentration de CD8α présent dans l’échantillon.

Courbe standard d’un ELSIA compétitif : exemple d’une courbe standard d’un ELISA compétitif pour le kit ELISA prepronociceptin (PNOC) humain. La diminution de la densité optique lue à 450 nm (OD450) corrèle avec la quantité de PNOC dans l’échantillon.

Calculer la concentration (auparavant inconnue) d’un échantillon test :

Step Procedure

1.

Calculer l’absorbance moyenne des réplicas de chaque échantillon (tests et standards). La déviation standard pour chaque échantillon ne doit pas excéder 20%.

2.

Créer la courbe standard à partir des échantillons standards

3.

Tracer un graphe représentant l’absorbance (en ordonnée) en fonction de la concentration de l’analyte (en abscisse) en utilisant un logiciel de calcul tel qu’Excel

4.

Tracer la meilleure courbe de régression mathématique passant par les points du graph.

5.

Pour chaque échantillon test, tracer sur le graphe de la courbe standard une ligne horizontale partant de la valeur de l’absorbance de l’échantillon sur l’axe Y.

6.

Lorsque cette ligne atteint la courbe standard, tracer alors une ligne verticale rejoignant l’axe X : le point d’intersection correspond à la concentration de l’analyte recherché dans l’échantillon.

7.

Pour obtenir un résultat précis, les échantillons doivent souvent être dilués avant de réaliser le protocole ELISA. Si tel est le cas, il convient alors de multiplier la concentration lue sur le graphe de la courbe standard par le facteur de dilution, afin d’obtenir la concentration réelle de l’analyte dans l’échantillon non-dilué.

Calculer le coefficient de variation :

Le coefficient de variation aide à identifier des inconsistances et des inexactitudes dans les résultats. Ce coefficient est exprimé comme un pourcentage d’écart à la moyenne. Plus cet écart est important, plus l’est également l’inconsistance et l’inexactitude de la concentration déterminée pour l’échantillon. Le coefficient de variation est le rapport de la déviation standard sigma sur la moyenne µ : CV = σ/µ.

Un fort coefficient de variation peut être attribué à :

  • Des inexactitudes de pipetage ;
  • Une contamination de l’échantillon par une bactérie/un champignon ou un autre réactif ;
  • Une variation de température : les plaques doivent être incubées à température stable, à l’abri des courants d’air ;
  • Un assèchement des puits dans les plaques : les plaques doivent toujours être couvertes lors des étapes d’incubation.

Chez ELISA Genie, chaque kit que nous produisons est analysé pour déterminer sa sensibilité et son amplitude de détection, ainsi que son coefficient de variation inter- et intra-essai. Ceci vous permettra de connaître les pleines aptitudes de nos kits ELISA, y compris leur variabilité, avant achat.

Recouvrement de dose (“spike recovery”) :

Un recouvrement de dose permet de déterminer si l’un des composants de l’échantillon interfère avec la liaison anticorps-antigène, une étape clé du test l’ELISA. La matrice de l’échantillon est dosée avec une concentration connue de l’analyte cible. Le test ELISA est effectué et la concentration de l’analyte est déterminée à partir de la courbe standard. Le recouvrement est typiquement présenté comme un pourcentage. Toute valeur inférieure à 80% signifie généralement que les composants de la matrice interfèrent avec le test ELISA, et qu’un kit différent devrait être utilisé. Chez ELISA Genie, nous comprenons le besoin de démontrer l’exactitude de nos kits ELISA, et nous savons également à quel point il est important de regarder si quoique ce soit dans la matrice de l’échantillon interfère avec la liaison anticorps-antigène. C’est pour cela que nous procédons avec soin à des tests de linéarité et de recouvrement de dose sur chacun des lots de kits ELISA que nous produisons.

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