細胞溶解向け超音波処理プロトコル

はじめに

超音波処理は、サンプル中の粒子に音エネルギーを当てて攪拌を行います。使用される超音波周波数は通常20kHzより大きいものです。実験時の設定では通常、超音波処理器または超音波プローブを使用したものが一般的に超音波処理といわれます。

ラボにおける超音波処理は主に細胞破砕の手段として使われています。超音波処理は細胞膜を破砕し細胞中の内容物を流出するのに使用され、このプロセスを通常ソノポレーションと呼びます。超音波処理は細胞を分解するために抽出タンパク質を準備する際に実行されます。溶解バッファーも使えますが、超音波処理で細胞を溶解できます。超音波処理はまた断片化/シアーDNAにも用いることができ、更なるサンプル準備と干渉することを防ぐことができます。その他の生物学的な用途としてはナノ粒子やリポソームの製造、アントシアニンや抗酸化物質の抽出を含みます。

細胞のタイプによっては(細菌性もしくは真核性)、特定の細胞タイプを溶解するのは難しいことがあり、洗浄バッファーに単独で入れてもフルの細胞溶解にはならないことがあります。さらには、サイトゾルを放出するために細胞壁を溶融するだけではなく、細胞器官を溶解する必要がある場合もあります。チタンプローブを用いた細胞の超音波処理によって細胞を完全に溶融し、全てのDNAとRNA、細胞の内容タンパク質を抽出する助けとなります。これにより下流工程でELISAアッセイと免疫沈降のためにより均質な抽出物を探す際に役立ちます。

超音波処理

下記の細胞溶解向け超音波処理プロトコルに従うことで、必要な用途向けの効率的な細胞溶解を達成することができるでしょう。

  1. 微小遠心管の中で細胞を5分間270 x gで遠心分離する。
  2. 残存溶液を吸引し細胞を30-100μLのRIPAバッファーで再懸濁する。
  3. ペレットを氷の上で30分間培養する。
  4. サンプルを下記の通り超音波処理する。
  5. 超音波プローブを20kHzの周波数で設置する。
  6. 細胞を1.5mLの微小遠心管に入れ、超音波プローブの先端の下でゆっくり動かす。
  7. プローブが粘度を落とすためにバッファーを10秒x2回振動し始める(これによりサンプルが泡立つことがあります)
  8. このプロトコルでは、免疫沈降やウェスタンブロット法、ELISAアッセイに続く場合には、サンプルの泡は次の超音波処理でも問題になりません。
  9. サンプルとその粘度によっては、細胞をさらに10秒間超音波処理することもあります。
  10. サンプルの超音波処理が終わったら、氷の上で5分間培養します。
  11. ペレットデブリに10,000 x gで20分間遠心をかけます(デブリには溶解しなかった細胞や核、小器官が含まれます)
  12. 上澄みを新しい微小遠心管に移しラベルします。
  13. -20℃で保管して下さい。

細菌性細胞のサルコシル溶解と超音波分解

  1. BL21細胞のサルコシル溶解と除去済シャペロンタンパク質BL21細菌ペレットを50mLのよく冷えたナトリウムTris-EDTA (STE) バッファー (10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 100 mM PMSFで補正された150 mM NaCl)で再懸濁する。
  2. 500μlのリゾチーム(10mg/ml)を加え氷の上で15分間培養する。
  3. 500μlのDTTと7mlのサルコシル(STE溶液で10% (w/v)にしたもの)を加える。
  4. 全ての精製バッファーは氷点下に保ちサンプルは氷上で保持する。全ての精製ステップは可能であればコールドルームで実行する。
  5. サンプルを2分間のインターバルを挟みながら30秒間で3回超音波処理する。
  6. さらなる精製ステップのためにサンプルを氷に置き-80℃で保存する。

ヒントとコツ

  1. 常にサンプルを氷上に置いて下さい。処理器からのエネルギーでサンプルが分解し加熱されます。もしサンプルが熱くなり過ぎるとタンパク質が劣化し始めます。これを防ぐため、サンプルを処理前・最中・後と常に可能な限り氷に置いて下さい。
  2. パルス処理によってサンプルの温度を下げて下さい。ほとんどの処理器はパルスモードがあり、超音波処理中のサンプルの加熱を減らします。もしパルシングが利用不可/オプションにない場合、処理器を5秒間オンにしてから切って下さい。必要に応じて何度もリピートして下さい。
  3. 処理し過ぎないこと。サンプルを長時間に超音波処理しすぎるとタンパク質が劣化します。完璧なバランスを見つけるには多少の試行錯誤が必要で、異なる細胞や組織タイプ、サンプル量によって変わります。
  4. サンプル量とプローブサイズですが、使用するプローブはサンプル量によって変わります。各プローブには推奨サンプル量レンジがあります。小さいチップ(マイクロチップ)は50mL以下の小さく薄いベッセル内のサンプル処理向け推奨です。マイクロチップは短い処理時間向けに作られています。マイクロチップは小量でもかなりの量の熱を産出するので、熱のビルドアップを防ぐためにパルスモードで使用すべきです。
  5. 耳を防護して下さい。超音波処理は超音波を使用するので、人間の可聴域外ですが小さなキャビテーション泡の弾ける音が大きな高いノイズを発生させます。何らかの適切な耳の防護用具を付け、耳を覆うようにして下さい。
  6. なるべく泡を制限して下さい。もしプローブが適切にサンプルに浸っていないと泡に繋がり、逆に深過ぎると適切な溶解が得られません。泡ができてもパニックになる必要はありません。免疫沈降やウェスタンブロット法、ELISAアッセイの際には問題にはなりません。
  7. 振幅に関しては、ゆっくり着実にやる必要があります。全ての実験に言えますが、機器を最大ボルト数に上げたり、細胞を半分の時間で変形させる誘惑は大きいものですが、これだと大抵プレゼンしたり出版できるような結果にはなりません。超音波処理では低い振幅で長時間行うことにより、サンプルの加熱が減少し、その間に別の実験に取り組めます。振幅と強度には直接的な関係があります。結果を再現できるようにするには、振幅の設定、温度、粘度とサンプル量は、全て一定に保つ必要のあるパラメーターです。超音波処理の結果を再現するには、パワーではなく振幅が最も重要になります。
  8. 常にサンプル毎に処理器の先端を清掃して下さい。これはタンパク質の持ち越しを制限するために極めて重要です。処理器プローブを70%エタノールかビーカー内のエタノール溶液で拭うことは、処理器先端の掃除をする効果的な方法です。