細胞溶解用超音波処理プロトコル
実験プロトコル · 日本語
細胞溶解のための超音波処理プロトコル
超音波処理による細胞破砕の原理から、哺乳類細胞・細菌の溶解プロトコル、再現性を高めるためのヒントまでを日本語でまとめました。
← 日本語リソースへ戻る1はじめに
超音波処理（ソニケーション）は、サンプル中の粒子に音エネルギーを与えて撹拌する手法で、通常 20 kHz より高い周波数を用います。超音波処理器（ソニケーター）や超音波プローブを使う操作を一般に超音波処理と呼びます。
ラボでは主に細胞破砕の手段として使われます。超音波は細胞膜を破砕して内容物を流出させ（ソノポレーション）、抽出タンパク質の調製に用いられます。溶解バッファー単独でも溶解できますが、超音波処理でも細胞を溶解できます。DNA の断片化・シアーにも利用でき、後続のサンプル調製での干渉を防げます。その他、ナノ粒子・リポソームの製造、アントシアニンや抗酸化物質の抽出にも使われます。
細胞のタイプ（細菌または真核生物）によっては溶解が難しく、界面活性剤入りバッファー単独では完全に溶解できないことがあります。細胞質を放出するために細胞壁を溶解するだけでなく、細胞内小器官の溶解が必要な場合もあります。チタンプローブを用いた超音波処理では細胞を完全に溶解でき、DNA・RNA・細胞内タンパク質をすべて抽出できます。ELISA や免疫沈降向けに均質な抽出物を得たい場合に役立ちます。
2超音波処理プロトコル（哺乳類細胞）
以下の細胞溶解向け超音波処理プロトコルに従うことで、用途に合った効率的な細胞溶解が行えます。
哺乳類細胞の溶解
- 細胞を 270 × g で 5 分間遠心分離します。
- 残存溶液を吸引し、細胞を 30〜100 µL の RIPA バッファーで再懸濁します。
- ペレットを氷上で 30 分間静置します。
- 超音波プローブを 20 kHz の周波数で準備します。
- 細胞を 1.5 mL チューブに入れ、プローブ先端の下でゆっくり動かします。
- 粘度を下げるため、プローブでバッファーを 10 秒 × 2 回振動します（泡立つことがあります）。
- 免疫沈降・ウェスタンブロット・ELISA に使用する場合、サンプルの泡は問題になりません。
- サンプルとその粘度に応じて、さらに 10 秒間超音波処理します。
- 処理後は氷上で 5 分間静置します。
- デブリをペレット化するため、10,000 × g で 20 分間遠心します（デブリには未溶解の細胞・核・小器官が含まれます）。
- 上清を新しいチューブに移してラベルします。
- -20℃ で保管します。
3細菌のサルコシル溶解と超音波分解
細菌のサルコシル溶解と超音波分解
- サルコシル溶解でシャペロンタンパク質を除去した BL21 細菌ペレットを、50 mL のよく冷えた STE バッファー（10 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM EDTA、150 mM NaCl に 100 mM PMSF を添加）で再懸濁します。
- リゾチーム（10 mg/mL）500 µL を加え、氷上で 15 分間静置します。
- DTT 500 µL と、STE 溶液で 10%（w/v）にしたサルコシル 7 mL を加えます。
- すべての精製バッファーはよく冷やし、サンプルは氷上に置きます。可能であれば精製ステップはコールドルームで行います。
- サンプルを 2 分間のインターバルを挟みながら、30 秒間の超音波処理を 3 回行います。
- さらなる精製のためサンプルを氷上に置くか、-80℃ で保存します。
4ヒントとコツ
ヒントとコツ
- 常に氷上で: ソニケーターのエネルギーでサンプルが加熱され、熱くなりすぎるとタンパク質が分解します。処理の前・最中・後を通じて、できる限り氷上に置いてください。
- パルス処理: ほとんどの処理器にはパルスモードがあり、加熱を抑えられます。パルスがない場合は 5 秒オン／オフを必要に応じて繰り返します。
- 処理しすぎない: 長時間の超音波処理はタンパク質を分解します。細胞・組織タイプ・サンプル量で最適条件が異なるため、条件検討が必要です。
- サンプル量とプローブサイズ: プローブごとに推奨サンプル量があります。小さいチップ（マイクロチップ）は 50 mL 以下の少量・短時間処理向けで、発熱しやすいためパルスモードを使用してください。
- 耳を保護: 可聴域外でも、キャビテーション泡の破裂音が大きな引っかき音を生じます。適切な耳の保護具を着用してください。
- 泡の形成を防ぐ: プローブの浸し方が浅いと泡立ち、深すぎると十分に溶解できません。泡ができても IP・WB・ELISA では問題ありません。
- 振幅はゆっくり着実に: 低い振幅で長めに行うと加熱を抑えられます。再現性には、振幅設定・温度・粘度・サンプル量を一定に保つことが重要で、パワーよりも振幅が最も重要です。
- 先端の清掃: サンプルごとにプローブ先端を 70% エタノールで清掃し、タンパク質の持ち越しを防ぎます。
5関連する日本語ガイド
実験ワークフローに役立つ、その他の日本語ガイドもあわせてご覧ください。